本發(fā)明涉及微生物，具體涉及一種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88纖毛展示系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌表面展示是一項重要的生物工程技術(shù)，可將外源靶標(biāo)蛋白、多肽或其他生物大分子表達(dá)于細(xì)菌表面，能更好地還原其本來的生物學(xué)功能。該技術(shù)在生物催化、生物修復(fù)、生物傳感器和疫苗設(shè)計等多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。革蘭氏陰性菌尤其是大腸桿菌作為表面展示宿主菌具有天然優(yōu)勢，其中細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)(鞭毛、纖毛和性纖毛)為基礎(chǔ)的展示系統(tǒng)在用于疫苗時可以激活更強的免疫效果。

2、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic?escherichiacoli，etec)是引起新生動物如仔豬、犢牛、羔羊等腹瀉的主要病原菌之一，其致病性主要與其具有宿主特異性的纖毛粘附素(fimbrias)和黏附后分泌的腸毒素(enterotoxinsl)相關(guān)，新生仔豬大腸桿菌病是由含k88、k99等纖毛抗原的大腸桿菌引起的1周齡以內(nèi)仔豬急性高度致死性的腸道傳染病，通過纖毛黏附素吸附在新生仔豬小腸黏膜上，產(chǎn)生一種或幾種腸毒素，致使仔豬小腸中的水分和電解質(zhì)的含量發(fā)生改變，引起仔豬發(fā)生腹瀉。

3、多價亞單位疫苗一直以來是備受關(guān)注的細(xì)菌類疫苗開發(fā)類型，其具有廣譜性強，免疫原性高，動物應(yīng)激反應(yīng)小等優(yōu)點。目前市面上的etec疫苗分別有如下幾種：仔豬大腸桿菌k88ac-ltb雙價基因工程疫苗和使用多表位融合抗原(mefa)技術(shù)構(gòu)建的k88-k99-f18-f6-f41基因工程苗，上述疫苗菌種含有抗性基因，提純成本高，不含纖毛黏附素天然成分，免疫效果低于纖毛疫苗。然而，不同血清型的etec纖毛黏附素傳代穩(wěn)定性及產(chǎn)量大有不同，相較于k99等其他血清型，k88多次傳代后纖毛穩(wěn)定性最優(yōu)且產(chǎn)量最大。

4、本發(fā)明提供了一種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88纖毛展示系統(tǒng)，自身具有k88纖毛黏附素(faeg)，在融合了k99纖毛黏附素(fanc)抗原表位后，能夠表達(dá)雙纖毛黏附素抗原，使其能同時對兩種血清型菌株產(chǎn)生保護(hù)。本發(fā)明提供的etec-k88(faeg)-k99(fanc)重組菌，培養(yǎng)條件簡單，纖毛蛋白表達(dá)穩(wěn)定，提取和純化方法便捷，在降低成本的同時大幅提高了有效抗原含量，免疫效果更佳。此外，本發(fā)明提供的展示系統(tǒng)為研發(fā)新型豬腹瀉病多聯(lián)多價疫苗提供新工具。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了大腸桿菌etec-k88(faeg)-k99(fanc)纖毛蛋白，所述纖毛蛋白的氨基酸序列為seq?id?no.9所示。

2、本發(fā)明的另一個目的在于提供了大腸桿菌etec-k88(faeg)-k99(fanc)重組菌，該重組菌表達(dá)大腸桿菌etec-k88(faeg)-k99(fanc)纖毛蛋白。

3、本發(fā)明的最后一個目的在于提供了上述纖毛蛋白或重組菌在制備豬腹瀉病疫苗中的應(yīng)用。

4、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

5、申請人通過對k99?fanc序列進(jìn)行b細(xì)胞表位預(yù)測分析，申請人將fanc的基因分為不同的抗原區(qū)，將這些抗原區(qū)進(jìn)行了與faeg蛋白融合表達(dá)，將分離純化后的融合蛋白作為抗原對小鼠進(jìn)行免疫，篩選出最佳的融合蛋白為faeg-ep3，蛋白為seq?id?no.9所示本發(fā)明的保護(hù)范圍還包括：

6、seq?id?no.9所示faeg-ep3蛋白與與蛋白標(biāo)簽融合得到的融合蛋白。

7、seq?id?no.10所示faeg-ep3蛋白或上述融合蛋白的編碼基因。

8、以上所述的編碼基因，優(yōu)選的，為seq?id?no.10所示。

9、具有上述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞。

10、以上所述的重組載體，優(yōu)選的，為重組的pre112載體。

11、以上所述的重組微生物，優(yōu)選的，為重組的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88。

12、上述faeg-ep3蛋白，融合蛋白，seq?id?no.9所述蛋白或融合蛋白的編碼基因，具有上述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞在制備治療或預(yù)防豬腹瀉病疫苗中的應(yīng)用。

13、以上所述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的豬腹瀉病是由大腸桿菌k88血清型和/或大腸桿菌k99血清型導(dǎo)致的。

14、seq?id?no.9所示faeg-ep3蛋白的制備方法，包括將含有seq?id?no.9所述蛋白編碼基因的表達(dá)載體pre112，通過接合轉(zhuǎn)移的方式連接到產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88中。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

16、1.本發(fā)明首次將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88(o149血清型)纖毛作為展示系統(tǒng)，有效地將fanc表位展示在faeg骨架蛋白上，可以表達(dá)k99、k88雙黏附素，具有廣譜的免疫原性，可制備成針對豬腹瀉病原體的廣譜性疫苗，具備良好的免疫保護(hù)效果。

17、2.本發(fā)明制備的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌k88纖毛展示系統(tǒng)大腸桿菌etec-k88(faeg)-k99(fanc)，以產(chǎn)腸毒素大腸桿菌o149:k88ac血清型為表達(dá)載體，對k99-fanc短肽表位進(jìn)行表達(dá)，充分暴露大腸桿菌k99纖毛蛋白表位的同時，表達(dá)了k88天然構(gòu)象的纖毛蛋白，保證了原始的蛋白活性，蛋白表達(dá)穩(wěn)定，高效。

18、3.本發(fā)明對表達(dá)雙黏附素的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌進(jìn)行條件優(yōu)化，提取出含有天然構(gòu)象的雙黏附素菌毛蛋白，對解決豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌毛黏附素類型復(fù)雜具有重要的意義。

19、4.較之于單獨使用k88和k99纖毛蛋白，在達(dá)到相同的治療效果的基礎(chǔ)上，本發(fā)明蛋白的用量更少。

技術(shù)特征：

1.?一種人工合成的融合蛋白faeg-ep3，所述蛋白的氨基酸為seq?id?no.9所示。

2.?seq?id?no.9所示faeg-ep3蛋白與蛋白標(biāo)簽融合得到的融合蛋白。

3.?seq?id?no.9所示faeg-ep3蛋白或上述融合蛋白的編碼基因。

4.?根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，所述基因的多核苷酸為seq?id?no.10所示。

5.具有權(quán)利要求3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，為重組的pre112載體。

7.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組微生物，為重組的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌?k88。

8.權(quán)利要求1所述的faeg-ep3蛋白，權(quán)利要求2所述的融合蛋白，權(quán)利要求3所述的編碼基因，具有權(quán)利要求3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞在制備治療或預(yù)防豬腹瀉病疫苗中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述的豬腹瀉病是由大腸桿菌k88血清型和/或大腸桿菌k99血清型導(dǎo)致的。

10.?seq?id?no.9所示faeg-ep3蛋白的制備方法，包括將含有seq?id?no.9所述蛋白編碼基因的表達(dá)載體pre112，通過接合轉(zhuǎn)移的方式連接到產(chǎn)腸毒素大腸桿菌?k88中。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88纖毛展示系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用。申請人通過對K99?FanC序列進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測分析，申請人將FanC的基因分為不同的抗原區(qū)，將這些抗原區(qū)進(jìn)行了與FaeG蛋白融合表達(dá)，將分離純化后的融合蛋白作為抗原對小鼠進(jìn)行免疫，篩選出最佳的融合蛋白為FaeG?EP3，蛋白為SEQ?ID?NO.9所示。本申請在充分暴露大腸桿菌K99纖毛蛋白表位的同時，表達(dá)了K88天然構(gòu)象的纖毛蛋白，保證了原始的蛋白活性，蛋白表達(dá)穩(wěn)定，高效。對解決豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌毛黏附素類型復(fù)雜具有重要的意義。

技術(shù)研發(fā)人員：周丹娜,王雙雙,劉澤文,楊克禮,田永祥,劉威,高婷,袁芳艷,郭銳,李暢,吳瓊,朱佳佳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15