本發(fā)明屬于基因工程，涉及一種蘋果樹腐爛病菌致病基因及其應(yīng)用與dsrna。

背景技術(shù)：

1、由蘋果樹腐爛病菌(valsa?mali，簡稱v.mali)作為病原菌引起的蘋果樹腐爛病，發(fā)病嚴重時會造成死樹毀園。目前，對于其防治以化學藥劑為主，農(nóng)業(yè)和生物防治為輔。但是，長期施用化學藥劑帶來的對人畜毒副作用、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及病原菌抗藥性增強等問題至今難以有效解決。因此，亟需研制高效低毒以及環(huán)境友好的新型藥劑。

2、dsrna(double-stranded?rna)是植物、動物和真菌中自然發(fā)生的rna干擾(rnai)過程的一部分。在rnai中，dsrna分子通過與“目標”信使rna(mrna)的匹配序列結(jié)合來抑制基因的表達。由此，體外合成靶向病原菌關(guān)鍵基因的dsrna，通過外源噴灑的方法誘導病原菌靶標基因的沉默。dsrna可以通過注射、電穿孔和化學試劑介導的轉(zhuǎn)染等方式介入動物和細胞內(nèi)。dsrna的制備是實施rnai較為關(guān)鍵的一步。目前常用的dsrna制備方法主要有2種：體外轉(zhuǎn)錄法和體內(nèi)載體表達法。其中體外轉(zhuǎn)錄法合成dsrna可以在預(yù)期的pcr產(chǎn)物兩端連上轉(zhuǎn)錄起始點(如t7、sp6等)，先用rna聚合酶轉(zhuǎn)錄合成單鏈rna，再互補成dsrna。相比而言，要制備大量的dsrna，采用體內(nèi)載體表達法即構(gòu)建質(zhì)粒，在細菌體內(nèi)表達更為經(jīng)濟高效。帶有發(fā)夾環(huán)的dsrna包括2個反向互補的靶序列片段，中間插入一個單鏈環(huán)。通常構(gòu)建這樣的dna模板，需要3步連接(3步克隆法)實現(xiàn)。dsrna作為一種生物農(nóng)藥，相較于化學農(nóng)藥，具有環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，在真菌防治中的應(yīng)用是一種新興且有前景的領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于設(shè)計靶向蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25的dsrna藥劑，以期為后續(xù)蘋果樹腐爛病的綠色防控提供新的思路與技術(shù)儲備。對此，本發(fā)明提供了一種蘋果樹腐爛病菌致病基因及其應(yīng)用與dsrna來解決本領(lǐng)域內(nèi)的這種需要。

2、一方面，本發(fā)明涉及蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25在植物病害防治中的應(yīng)用，所述蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25的cds區(qū)域序列如seq?id?no：1所示，抑制v.mali內(nèi)所述蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25的表達，降低寄主植物中v.mali的生物量，削弱v.mali的毒力。

3、seq?id?no：1具體如下，

4、atgtcgggattcacacttccccagctcgtctttgagacaggaaacaagggcgctgcagccgtcgtctcaccagccctcggcaatgttacactctcgcgaactgaactgaaaagggtcagcttggaagctgctgatgctattcaggctcttcgcaaccgtgatgctcttggcattgaaggtcaacatgttgtagctatggcacttcctaatggcctccctttcgtccttgcatttctcggtgtgacggcaaggggtgttattgctgctcccctaaatcctgcatatactgttccggagtatgagttttatctgagtgacacaaaggccggggttctggtggtggatggacccaacgcaaaagagtccttccccggcattgtggcagctcgcaagttggggattcccgtatgttcgctggatgtgcaaatcaacaaagaagaagaggctgtgtcagtctccccgatcgtcaagccggttctcagggccgacgagggggctgccaatggcacgaatactgccgatgatgcatccattcctgctcctacgcccgacactctatgtttaatattgcacacatcaggcacaactggcacgccaaaggccgtcccgctatcacacgccaacttatcctgcagcgcgcgcaatgtcgccgcttcgtatgacttgggcgccgacgaccgtggctatttgatccaggtcctcttccacatccacggaatcgtggccagtctgctcgcgcctcttgtctcaggcggcagtgttgtcgttcctaacaagtttgacgcggcggtcacctggatcgagttcgcagctctgaagtgctcctggctctcaggcactccttcggcattacagatcctcctccatgcgcccaaggcaggctcagggctgggtatcaagttcctccgtagttgctcatcgccgttacttccgtcgactttcaaagccttgcaggaggttttccaatgtcccgttctcgaggcatatgctatgacagagaacgcccatcaaatgacaaccaatgtccccagcgatgctcagcctggttccgtggggaaagcagcagggactgtccgaatggccatatatggcgatgacgagaccgcagtcagtccgctcccggccaactcggagggcgaggtatgcatcacaggaccctcggtcacaaagggctaccttgagaaccctagcgccaacgagaaggcatttttcagagacgcagaaggtgtgcgctggttccgtaccggagatattggcgtgctcgacaatgagggtcatttaagaatcgttggccgcaggtccgagattatcaaccgcggcggcgagaaaatctcgccactcgaggtcgatgaagccatgatgctatgtgctgctccatacgtcagggaggcagcgtgcttctcagtccctgacgagttcttccaccaggaagttgaagccgccattgtgctttccgaggacgcgcctgacaacctgcgcgacggacatgagatccaacggctcttggagcagcggctcgcagccttcaagataccgaagcgtattcattactttgagggcaagattcctaaaggccctactggcaagattcagcgcgtgcagttgtccaagaagctggctcgttcgagcgggtcgtcggcaaatgctgcaggacaaggagaaaagaccactgacctccccgaacgtatcaggcagacgattatcgaagcactgcgtgtcgacccggcgatagtaaaggccgaaaccacacttctggagctcggtgccgactcgatgagcctgacgagaatgctgggcaacctccaccggctcggctgcagcatcaacatgtccgatgtcatcctcaatcctactgtccaacacgtcaccgacatctgcgtcagttcattttctgcaggcgagccagcatcagcggctgtcgctggaaacagcgtccaacaggtcgatgtccctgcccccttctccgtgctcaaagaggctcttgaagaagtggagggatcgccatcgctcgatgtcgtcttggcggacgttgccaagcagacaggattgcagcttgaccagcttgaggaggttctcccattatctccggagcagaaatggttccacgacgcggctgtcacttcaaagtggggcatgctcgacagtcaagtgagctgggttacggtcggtgcaccgattaaacccactgtggacattgagaagctcaagtgggccttcacggaggtgtccaaggtcgagccgttgccacggtctttctttgctatcatcccaggtaccaacgtgtgggtgcataccatcgcgaagccggacgtggtgccactcaactgggaagaatggtccgcggactcggaacaagctgctcttgacaggctccaggccgaacacttgagcttacgatacaggcctggtgtgcgaggctctaaactactccttgtcacctaccctaacaaagcgggcgagacgtgccgcgacttatacatggtggactcgcatgtcttgacagataacacatcccgcagcatgttgcgtgacaatgtcatcaagctttatcttggtgaggcaaccttagacaacctgccgcaggtgcccttgccctcggccgtcttgaccaaggccctccgaaaaaccagcaaggaaaattataccagcaagatgaggtactggcagagcgatattaagagccatggcatcactgggagaccagtgtatacagcccctccagagacaggcattcagtcatatactcaattccgtatcaacgaggatccagctaagaagacttccacctggaccggagacatcaacggcctctccgtcctcatgggcttgtcggcaccgactctgatccaatcaataatgccgctggccgtggccgccttcgagtaccagggcacgcgcaagatacccaaatcaaccgtctactcctacagcatctcggcacggtccggaatcatccccccgattcgcaacagcgagcagagccgcagctttggtgtcactgtgatgcccttcctcttcccgatgtccctcgccgagcagtcactgtggatgcacatacagcaggcgtcgctcaagcccgccgactcggtgaagcactaccacgtggaatcctgtgatgaaatcaagaactccgcgcccaccttcgtatggcgtgaactcgctgttggtagcgtgtggtcagaagttatcgacgctggtctcgagcgcttcgctgtcgaggtcacgtcccagacgtacatgttgtgtatgcgtctgggaattgatactctgatgatgattgatggggagagggatgagtatgccgagtggcggagccacaatggctatcctgtcagcctcgtcactgtgctgcagcgttgcctgacgttcttgtgtgagaacaaggagaatgtcgtcgatcttacattgactgacttgatccaagctgtatggacttag。

5、進一步地，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，所述蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25的非保守區(qū)域如seq?id?no：2所示。

6、seq?id?no：2具體如下，

7、tgcgtcagttcattttctgcaggcgagccagcatcagcggctgtcgctggaaacagcgtccaacaggtcgatgtccctgcccccttctccgtgctcaaagaggctcttgaagaagtggagggatcgccatcgctcgatgtcgtcttggcggacgttgccaagcagacaggattgcagcttgaccagcttgaggaggttctcccattatctccggagcagaaatggttccacgacgcggctgtcacttcaaagtggggcatgctcgacagtcaagtgagctgggttacggtcggtgcaccgattaaacccactgtggacattgagaagctcaagtgggccttcacggaggtgtccaaggtcgagccgttgccacggtctttctttgctatcatcccaggtaccaacgtgtgggtgcataccatcgcgaagccggacgtggtgccactcaactgggaagaatggtccgcggactcggaacaagctgctcttgacaggctccaggccgaacacttgagcttacgatacaggcctggtgtgcgaggctctaaactactccttgtcacctaccctaacaaagcgggcgagacgtgccgcgacttatacatggtggactcgcatgtcttgacagataacacatcccgcagcatgttgcgtgacaatgtcatcaagctttatcttggtgaggcaaccttagacaacctgccgcaggtgcccttgccctcggccgtcttgaccaaggccctccgaaaaaccagcaaggaaaattataccagcaagatgaggtactggcagagcgatattaagagccatggcatcactgggagaccagtgtatacagcccctccagagacaggcattcagtcatatactcaattccgtatcaacgaggatccagctaagaagacttccacctggaccggagacatcaacggcctctccgtcctcatgggcttgtcggcaccgactctgatccaatcaataatgccgctggccgtggccgccttcgagtaccagggcacgcgcaagatacccaaatcaaccgtctactcctacagcatctcggcacggtccggaatcatccccccgattcgcaacagcgagcagagccgcagctttggtgtcactgtgatgcccttcctcttcccgatgtccctcgccgagcagtcactgtggatgcacatacagcaggcgtcgctcaagcccgccgactcggtgaagcactaccacgtggaatcctgtgatgaaatcaagaactccgcgcccaccttcgtatggcgtgaactcgctgttggtagcgtgtggtcagaagttatcgacgctggtctcgagcgcttcgctgtcgaggtcacgtcccagacgtacatgttgtgtatgcgtctgggaattgatactctgatgatgattgatggggagagggatgagtatgccgagtggcggagccacaatggctatcctgtcagcctcgtcactgtgctgcagcgttgcctgacgttcttgtgtgagaacaaggagaatgtcgtcgatcttacattgactgacttgatccaagctgtatggacttag。

8、進一步地，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，所述寄主植物為蘋果，所述植物病害為蘋果樹腐爛病。

9、另一方面，本發(fā)明涉及一種抑制蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25表達的dsrna，所述蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25的cds區(qū)域序列如seq?id?no：1所示。

10、進一步地，在本發(fā)明提供的抑制蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25表達的dsrna中，所述dsrna的模板dna的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

11、另一方面，本發(fā)明涉及所述的抑制蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25表達的dsrna在制備v.mali防治產(chǎn)品中的應(yīng)用。

12、進一步地，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，所述v.mali防治產(chǎn)品降低寄主植物中v.mali的生物量。

13、進一步地，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，所述v.mali防治產(chǎn)品削弱v.mali的毒力。

14、進一步地，在本發(fā)明提供的應(yīng)用中，所述蘋果樹腐爛病的致病菌為v.mali。

15、另一方面，本發(fā)明涉及一種蘋果樹腐爛病的防治方法，其包括：所述蘋果樹腐爛病的致病菌為v.mali，將所述的抑制蘋果樹腐爛病菌致病基因vmnrps25表達的dsrna導入v.mali的體內(nèi)。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案至少具備以下有益效果或優(yōu)點：

17、本發(fā)明利用dsrna(雙鏈rna)技術(shù)來誘導蘋果樹腐爛病菌(v.mali)中致病基因vmnrps25的沉默，從而防治蘋果樹腐爛病。相較于傳統(tǒng)的化學農(nóng)藥，dsrna作為一種生物農(nóng)藥具有環(huán)境友好的特點，不易產(chǎn)生抗藥性。本發(fā)明針對蘋果樹腐爛病菌的特定致病基因vmnrps25設(shè)計dsrna，能夠精準靶向并抑制該基因的表達，從而有效降低寄主植物中v.mali的生物量，削弱其毒力，達到高效防治蘋果樹腐爛病的目的。