本發(fā)明屬于生物檢測，具體涉及用于測定楊樹黑星病菌交配型的引物組、多重pcr方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、楊樹黑星病是楊樹上一種重要的真菌病害。該病害主要侵染葉片，也可危害新梢。在葉片正面首先出現(xiàn)一個褪綠斑點(diǎn)，后逐漸形成深褐色的圓形壞死斑，葉片背面病斑上布滿黑色的霉層，常多個病斑相連，形成不規(guī)則的大斑。雨水沖刷后，斑痕會呈現(xiàn)出灰白色的外觀。發(fā)病嚴(yán)重時，造成葉片焦枯，提早脫落，是楊苗和幼林的危險性病害。研究發(fā)現(xiàn)我國的楊樹黑星病是由 venturia?phaeosepta引起，該病原菌是異宗配合的子囊菌，單個菌株中通常僅存在mat1-1-1基因或mat1-2-1基因，帶有mat1-1-1基因的菌株為mat1-1交配型，帶有mat1-2-1基因的菌株為mat1-2交配型，只有2個不同交配型的菌株相遇才能夠進(jìn)行有性生殖。

2、有性生殖是植物病原真菌遺傳變異的重要來源，也是導(dǎo)致植物病原真菌毒性變異的重要因素，可以大大增強(qiáng)其適應(yīng)性和生存力。異宗配合的真菌需要群體中同時存在兩種不同的交配型菌株才能進(jìn)行有性生殖，因此明確群體中兩種交配型的分布情況，對于判斷群體中是否存在有性生殖至關(guān)重要。傳統(tǒng)的交配型測定方法為對峙培養(yǎng)法，該方法測定時間長達(dá)1-2個月，有時還需要特殊的光照條件和低溫刺激，不適合大規(guī)模樣本的測定。而目前發(fā)展的pcr分子檢測方法，具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，特別適合大規(guī)模樣本的測定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供用于測定楊樹黑星病菌交配型的引物組、多重pcr方法及應(yīng)用，本發(fā)明以mat基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物，首次建立 venturia?phaeosepta交配型的多重pcr檢測方法，可大量、快速、準(zhǔn)確鑒定楊樹黑星病菌的交配型。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的具體方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供用于測定楊樹黑星病菌交配型的多重pcr引物組，包括通用上游引物hxmat-f、mat1-1特異性下游引物hxmat-1r和mat1-2特異性下游引物hxmat-2r；

4、所述hxmat-f的核苷酸序列如seq?id?no：3所示；

5、所述hxmat-1r的核苷酸序列如seq?id?no：4所示；

6、所述hxmat-2r的核苷酸序列如seq?id?no：5所示.

7、第二方面，本發(fā)明提供用于測定楊樹黑星病菌交配型的試劑盒，包含上述的多重pcr引物組。

8、第三方面，本發(fā)明提供上述的多重pcr引物組或試劑盒在測定楊樹黑星病菌交配型中的應(yīng)用。

9、第四方面，一種用于測定楊樹黑星病菌交配型的多重pcr方法，包括以下步驟：

10、步驟一、提取待測病菌的dna；

11、步驟二、以步驟一所得dna為模板，使用權(quán)利要求1所述的引物組進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增；

12、步驟三、根據(jù)步驟二擴(kuò)增所得條帶的大小進(jìn)行交配型的判定。

13、作為對上述多重pcr方法的進(jìn)一步優(yōu)化，步驟三所述判定的依據(jù)為：若條帶大小為280bp，則測定為mat1-2交配型；若條帶大小為630bp，則測定為mat1-1交配型。

14、有益效果：本發(fā)明通過全基因組測序獲得mat基因序列，以mat基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物，建立 venturia?phaeosepta交配型的多重pcr檢測方法。該方法為楊樹黑星病菌交配型的首個分子檢測方法，分子方法的建立將為大量、快速和準(zhǔn)確鑒定楊樹黑星病菌的交配型提供有力支持。

技術(shù)特征：

1.用于測定楊樹黑星病菌交配型的多重pcr引物組，其特征在于：包括通用上游引物hxmat-f、mat1-1特異性下游引物hxmat-1r和mat1-2特異性下游引物hxmat-2r；

2.用于測定楊樹黑星病菌交配型的試劑盒，其特征在于：包含權(quán)利要求1所述的多重pcr引物組。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重pcr引物組或權(quán)利要求2所述的試劑盒在測定楊樹黑星病菌交配型中的應(yīng)用。

4.一種用于測定楊樹黑星病菌交配型的多重pcr方法，其特征在于：包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟三所述判定的依據(jù)為：若條帶大小為280bp，則測定為mat1-2交配型；若條帶大小為630bp，則測定為mat1-1交配型。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及用于測定楊樹黑星病菌交配型的引物組、多重PCR方法及應(yīng)用，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明首先通過全基因組測序獲得MAT基因序列，然后挖掘交配型位點(diǎn)序列，基于MAT1?1和MAT1?2位點(diǎn)的序列差異設(shè)計(jì)出了特性性交配型引物，建立了楊樹黑星病菌交配型的多重PCR檢測方法，該方法為楊樹黑星病菌交配型的首個分子檢測方法，分子方法的建立將為大量、快速和準(zhǔn)確鑒定楊樹黑星病菌的交配型提供有力支持。

技術(shù)研發(fā)人員：胡艷紅,董恒,崔林開,方宇峰,宋康巖
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河南科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15