本技術(shù)涉及生物，具體涉及一種重組透明質(zhì)酸酶純化方法及生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

1、透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，haase)是指能夠?qū)⑼该髻|(zhì)酸(hyaluronan或hyaluronic?acid，ha)及部分糖胺聚糖(glycosaminoglycan，gag)降解成二糖或小分子寡糖的一類糖苷酶。透明質(zhì)酸酶可作為藥物擴(kuò)散劑，降解人體組織的透明質(zhì)酸以增加其通透性，促進(jìn)注射液的擴(kuò)散，可用于制備有生物活性的低分子量聚胺寡糖，也可用于降解動(dòng)物皮革組織的糖胺聚糖，替代傳統(tǒng)皮革制備工藝中石灰法，以降低環(huán)境污染。

2、目前，已批準(zhǔn)上市的透明質(zhì)酸酶產(chǎn)品為動(dòng)物源透明質(zhì)酸酶或人工重組透明質(zhì)酸酶(以下簡稱重組透明質(zhì)酸酶)。然而，動(dòng)物源透明質(zhì)酸酶受制于其來源及純化途徑，且存在過敏，病毒污染等潛在風(fēng)險(xiǎn)，在免疫原性、純度、安全性等方面均劣于重組透明質(zhì)酸酶。相較于動(dòng)物源透明質(zhì)酸酶，重組透明質(zhì)酸酶具有免疫原性高、無副作用、純度高、活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、無外源性污染等優(yōu)點(diǎn)。

3、相關(guān)技術(shù)中，重組透明質(zhì)酸酶的純化普遍采用包括陰離子交換層析、疏水層析、親和層析(以苯硼酸為填料)和復(fù)合層析(cht)在內(nèi)的方法進(jìn)行純化。其中，進(jìn)行陰離子交換層析時(shí)所用填料為q填料(即q-瓊脂糖凝膠填料)，上樣條件ph＝7.0，上樣后采用含400mmol/l氯化鈉的磷酸緩沖液作為洗脫液對陰離子交換層析柱進(jìn)行洗脫；然后用2mol/l(nh4)2so4溶液對樣品進(jìn)行調(diào)節(jié)，使樣品中(nh4)2so4濃度為0.5mol/l，以便于采用疏水層析流穿模式進(jìn)行層析，進(jìn)行疏水層析時(shí)所用填料為含phenyl(即苯基)的填料，疏水流穿樣品直接上樣至含苯硼酸填料的親和層析柱中，然后采用ph為9.0的……緩沖液進(jìn)行淋洗，并采用ph為6.0的hepes緩沖液(即羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液)進(jìn)行洗脫，洗脫后的樣品進(jìn)行復(fù)合層析，進(jìn)行復(fù)合層析時(shí)所用填料為羥基磷灰石填料，采用ph為6.9且濃度為5mmol/l的pb緩沖液(即磷酸緩沖液)作為平衡液，采用含0.1mm?cacl2、ph為7.4且濃度為80mm的pb緩沖液作為洗脫液對復(fù)合層析柱進(jìn)行洗脫。然而，進(jìn)行復(fù)合層析時(shí)所采用的羥基磷灰石填料的使用壽命短，裝柱困難；且采用該方法純化重組透明質(zhì)酸酶，蛋白收率(57.8％)和成品純度(89.1％)均較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種重組透明質(zhì)酸酶純化方法及生產(chǎn)方法，以解決上述裝柱困難、蛋白收率和成品純度較低等技術(shù)問題。

2、自含目的重組透明質(zhì)酸酶的細(xì)胞培養(yǎng)液中純化目的蛋白(例如重組透明質(zhì)酸酶)面臨以下問題：雜質(zhì)種類較多，且雜質(zhì)數(shù)量龐大，這些雜質(zhì)的大小或大于目的蛋白(即目標(biāo)蛋白)，或小于目的蛋白，甚至與目的蛋白大小相同，這使得純化過程成為一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。

3、發(fā)明人對相關(guān)技術(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，采用現(xiàn)有技術(shù)純化重組透明質(zhì)酸酶，疏水層析后陽離子層析上樣過程中需對樣品進(jìn)行高倍數(shù)稀釋，稀釋不完全所致目標(biāo)蛋白未完全吸附于填料上，目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)的分離不理想，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白收率和成品純度較低；親和層析通過與目標(biāo)分子的順式二元醇進(jìn)行結(jié)合，哺乳動(dòng)物表達(dá)的重組蛋白大多有此結(jié)構(gòu)，特異性較低，無法有效分離目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)，進(jìn)一步降低了蛋白收率和成品純度。

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)的方案如下：

5、第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種重組透明質(zhì)酸酶純化方法，所述重組透明質(zhì)酸酶純化方法包括以下步驟：收集含目的重組透明質(zhì)酸酶的細(xì)胞培養(yǎng)液，澄清處理后收集上清液；將所述上清液依次進(jìn)行陰離子交換層析、陽離子交換層析和疏水層析。

6、本技術(shù)中，術(shù)語“疏水層析”表示采用“疏水材料”的層析方法，“疏水材料”指其中疏水基團(tuán)，如丁基、辛基或苯基結(jié)合為層析官能團(tuán)的層析材料。

7、本技術(shù)中，術(shù)語“離子交換層析”表示使用“離子交換層析材料”的層析方法。術(shù)語“離子交換層析材料”根據(jù)在“陽離子交換層析”中是否交換陽離子表示“陽離子交換層析材料”或在“陰離子交換層析”中是否交換陰離子表示“陰離子交換層析材料”?！半x子交換層析材料”具有將其非共價(jià)結(jié)合的抗衡離子交換成周圍溶液的類似荷電離子的能力。根據(jù)其可交換抗衡離子的電荷，“離子交換層析材料”被稱為“陽離子交換層析材料”或“陰離子交換層析材料”。

8、本技術(shù)中，術(shù)語“上樣”、“洗脫”表示層析方法的操作方式，其中上樣使含有目標(biāo)蛋白的溶液與填料等固定相，優(yōu)選固相接觸，由此目標(biāo)蛋白結(jié)合固定相。結(jié)果，目標(biāo)蛋白停留在固定相上，而非目標(biāo)蛋白從流動(dòng)相或上清液中去除。然后在后續(xù)過程中從固定相中洗脫目標(biāo)蛋白，并由此用洗脫液從固定相中將其回收。

9、可選地，進(jìn)行所述陰離子交換層析時(shí)所用填料為鍵合有三甲胺基烷基季銨基團(tuán)的瓊脂糖微球。

10、可選地，所述鍵合有三甲胺基烷基季銨基團(tuán)的瓊脂糖微球?yàn)閝-瓊脂糖凝膠ff填料。

11、可選地，所述陰離子交換層析過程中，酶活載量小于1.8×105u/ml，優(yōu)選為1.65×105u/ml-1.8×105u/ml。

12、可選地，所述陰離子交換層析過程中，上樣條件為：樣品ph為7.2-7.8，優(yōu)選為7.4-7.8且電導(dǎo)率小于11.5ms/cm。

13、可選地，上樣之前，所述陰離子交換層析還包括以下步驟：采用預(yù)平衡緩沖液對所采用的陰離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)平衡處理。

14、可選地，所述預(yù)平衡緩沖液為含氯化鈉且ph為7.2-7.8的緩沖液。

15、可選地，所述ph為7.2-7.8的緩沖液為磷酸緩沖液(即pb緩沖液)。

16、可選地，所述預(yù)平衡緩沖液中，所述氯化鈉的濃度為0.5-1.0mol/l，優(yōu)選為0.8-1.0mol/l。

17、可選地，所述預(yù)平衡緩沖液中，所述磷酸的濃度為15-25mmol/l，優(yōu)選為18-25mmol/l。

18、可選地，所述預(yù)平衡緩沖液的ph為7.2-7.8，優(yōu)選為7.4-7.8。

19、可選地，所述預(yù)平衡緩沖液與所述陰離子交換層析柱的體積比為2-4：1，優(yōu)選為2.5-4：1。

20、可選地，預(yù)平衡之前，所述陰離子交換層析還包括以下步驟：采用堿液對所述陰離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)消毒。

21、可選地，對所述陰離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)消毒時(shí)，所用堿液為氫氧化鈉溶液。

22、可選地，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.5-1.0mol/l，優(yōu)選為0.6-1mol/l。

23、可選地，所述氫氧化鈉溶液與所述陰離子交換層析柱的體積比為5-8：1，優(yōu)選為6-8：1。

24、可選地，所述陰離子交換層析過程中，采用線性洗脫方式進(jìn)行洗脫。

25、可選地，所述陰離子交換層析過程中，以ph為7.2-7.8的緩沖液作為平衡液，以含氯化鈉且ph為7.2-7.8的緩沖液作為洗脫液，平衡液與洗脫液呈線性洗脫方式進(jìn)行洗脫。

26、可選地，所述ph為7.2-7.8的緩沖液為磷酸緩沖液。

27、可選地，所述陰離子交換層析過程中，線性洗脫時(shí)，洗脫梯度為2-70％洗脫液。

28、可選地，所述陰離子交換層析過程中，線性洗脫時(shí)，洗脫體積為10-20倍柱體積，優(yōu)選為12-18倍柱體積。

29、可選地，所述平衡液的ph為7.2-7.8，優(yōu)選為7.4-7.8。

30、可選地，所述平衡液的濃度為15-25mmol/l，優(yōu)選為18-25mmol/l。

31、可選地，所述洗脫液中，所述氯化鈉的濃度為0.8-1.5mol/l，優(yōu)選為1.0-1.5mol/l。

32、可選地，所述洗脫液中，所述磷酸的濃度為15-25mmol/l，優(yōu)選為18-25mmol/l。

33、可選地，所述洗脫液的ph為7.2-7.8，優(yōu)選為7.4-7.8。

34、可選地，洗脫之后，所述陰離子交換層析還包括以下步驟：采用再生液對所述陰離子交換層析柱進(jìn)行再生。

35、可選地，所述再生液為含氯化鈉且ph為7.2-7.8的緩沖液。

36、可選地，所述且ph為7.2-7.8的緩沖液為磷酸緩沖液。

37、可選地，所述再生液中，所述氯化鈉的濃度為0.8-1.5mol/l，優(yōu)選為1.0-1.5mol/l。

38、可選地，所述再生液中，所述磷酸的濃度為15-25mmol/l，優(yōu)選為18-25mmol/l。

39、可選地，所述再生液的ph為7.2-7.8，優(yōu)選為7.4-7.8。

40、可選地，所述再生液與所述陰離子交換層析柱的體積比為2-4：1，優(yōu)選為3-4：1。

41、可選地，再生之后，所述陰離子交換層析還包括以下步驟：采用堿液對所述陰離子交換層析柱進(jìn)行消毒。

42、可選地，對所述陰離子交換層析柱進(jìn)行消毒時(shí)，所用堿液為氫氧化鈉溶液。

43、可選地，所述堿液的濃度為0.5-1.0mol/l，優(yōu)選為1.0mol/l。

44、可選地，所述堿液與所述陰離子交換層析柱的體積比為5-8：1，優(yōu)選為6-8：1。

45、可選地，進(jìn)行所述陽離子交換層析時(shí)所用填料為磺酸酯陽離子交換樹脂填料。

46、可選地，所述磺酸酯陽離子交換樹脂填料為capto?s?impact填料。

47、可選地，所述陽離子交換層析過程中，蛋白載量為5-10g/l，優(yōu)選為6-10g/l。

48、可選地，所述陽離子交換層析過程中，上樣條件為：樣品ph為4.8-5.2，優(yōu)選為4.9-5.2，且電導(dǎo)率小于8.5ms/cm。

49、可選地，上樣之前，所述陽離子交換層析還包括以下步驟：采用平衡液對所采用的陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理。

50、可選地，對所采用的陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液為ph為4.8-5.2的緩沖液。

51、可選地，所述ph為4.8-5.2的緩沖液為醋酸鈉(naac)-醋酸(hac)緩沖液。

52、可選地，對所采用的陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液中，所述醋酸鈉的濃度為45-55mmol/l，優(yōu)選為48-55mmol/l。

53、可選地，對所采用的陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液的ph為4.8-5.3，優(yōu)選為4.9-5.3。

54、可選地，對所采用的陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液與所述陽離子交換層析柱的體積比為4-7：1，優(yōu)選為5-7：1。

55、可選地，平衡處理之前，所述陽離子交換層析還包括以下步驟：采用預(yù)平衡緩沖液對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)平衡處理。

56、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)平衡處理時(shí)，所用預(yù)平衡緩沖液為含氯化鈉且ph為4.8-5.2的緩沖液。

57、可選地，所述ph為4.8-5.2的緩沖液為醋酸鈉-醋酸緩沖液。

58、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)平衡處理時(shí)，所用預(yù)平衡緩沖液中，所述氯化鈉的濃度為0.5-1.5mmol/l，優(yōu)選為0.8-1.5mmol/l。

59、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)平衡處理時(shí)，所用預(yù)平衡緩沖液中，所述醋酸鈉的濃度為45-55mmol/l，優(yōu)選為48-55mmol/l。

60、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)平衡處理時(shí)，所用預(yù)平衡緩沖液的ph為4.8-5.3，優(yōu)選為4.9-5.3。

61、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行預(yù)平衡處理時(shí)，所用預(yù)平衡緩沖液與所述陽離子交換層析柱的體積比為2-4：1，優(yōu)選為3-4：1。

62、可選地，所述陽離子交換層析過程中，采用線性洗脫方式進(jìn)行洗脫。

63、可選地，所述陽離子交換層析過程中，以ph為4.8-5.2的緩沖液作為平衡液，以含氯化鈉且ph為4.8-5.2的緩沖液作為洗脫液，平衡液與洗脫液呈線性洗脫方式進(jìn)行洗脫。

64、可選地，所述ph為4.8-5.2的緩沖液為醋酸鈉-醋酸緩沖液。

65、可選地，所述陽離子交換層析過程中，洗脫梯度為0-50％洗脫液。

66、可選地，所述陽離子交換層析過程中，洗脫體積為15-25倍柱體積，優(yōu)選為18-23倍柱體積。

67、可選地，上樣之后、洗脫之前，所述陽離子交換層析還包括以下步驟：采用平衡液對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理。

68、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液為ph為4.8-5.2的緩沖液。

69、可選地，所述ph為4.8-5.2的緩沖液為醋酸鈉-醋酸緩沖液。

70、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液中，所述醋酸鈉的濃度為45-55mmol/l，優(yōu)選為48-55mmol/l。

71、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液的ph為4.8-5.3，優(yōu)選為4.8-5.2。

72、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液與所述陽離子交換層析柱的體積比為4-7：1，優(yōu)選為5-7：1。

73、可選地，洗脫之后，所述陽離子交換層析還包括以下步驟：采用再生液對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行再生。

74、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行再生時(shí)，所用再生液為含氯化鈉且ph為4.8-5.2的緩沖液。

75、可選地，所述ph為4.8-5.2的緩沖液為醋酸鈉-醋酸緩沖液。

76、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行再生時(shí)，所用再生液中，所述氯化鈉的濃度為0.5-1.5mol/l，優(yōu)選為0.6-1.5mol/l。

77、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行再生時(shí)，所用再生液中，醋酸鈉的濃度為45-55mmol/l，優(yōu)選為48-55mmol/l。

78、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行再生時(shí)，所用再生液的ph為4.8-5.3，優(yōu)選為4.9-5.3。

79、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行再生時(shí)，所用再生液與所述陽離子交換層析柱的體積比為2-4:1，優(yōu)選為3-4：1。

80、可選地，再生之后，所述陽離子交換層析還包括以下步驟：采用堿液對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行消毒。

81、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行消毒時(shí)，所用堿液為氫氧化鈉溶液。

82、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行消毒時(shí)，所用堿液的濃度為0.5-1.0mol/l，優(yōu)選為1.0mol/l。

83、可選地，對所述陽離子交換層析柱進(jìn)行消毒時(shí)，所用堿液與所述陽離子交換層析柱的體積比為2-4：1，優(yōu)選為3-4：1。

84、可選地，進(jìn)行所述疏水層析時(shí)所用填料為苯基疏水層析填料。

85、可選地，所述苯基疏水層析填料選自diamond?phenyl?mustang填料或captophenyl?impres填料。

86、可選地，所述疏水層析過程中，蛋白載量小于5g/l。

87、可選地，所述疏水層析過程中，上樣條件為：樣品ph為6.8-7.3、電導(dǎo)率為70-135ms/cm且含0.5-1.7mol/l無機(jī)鹽。

88、可選地，所述無機(jī)鹽選自硫酸銨或氯化鈉。

89、可選地，當(dāng)無機(jī)鹽選自硫酸銨時(shí)，所述疏水層析過程中，上樣條件為：樣品ph為6.8-7.3、電導(dǎo)率為70-90ms/cm且含0.5-0.7mol/l硫酸銨。

90、可選地，當(dāng)無機(jī)鹽選自氯化鈉時(shí)，所述疏水層析過程中，上樣條件為：樣品ph為6.8-7.3、電導(dǎo)率為110-135ms/cm且含1.3-1.7mol/l氯化鈉。

91、可選地，上樣之前，所述疏水層析還包括以下步驟：采用平衡液對所采用的疏水層析柱進(jìn)行平衡處理。

92、可選地，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液為含無機(jī)鹽的磷酸緩沖液。

93、可選地，所述無機(jī)鹽選自硫酸銨或氯化鈉。

94、可選地，當(dāng)所述無機(jī)鹽選自硫酸銨時(shí)，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液中，所述硫酸銨的濃度為0.4-0.7mol/l，優(yōu)選為0.5-0.6mol/l。

95、可選地，當(dāng)所述無機(jī)鹽選自氯化鈉時(shí)，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液中，所述氯化鈉的濃度為1.3-1.7mol/l，優(yōu)選為1.4-1.6mol/l。

96、可選地，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液中，所述磷酸的濃度為15-25mmol/l，優(yōu)選為18-25mmol/l。

97、可選地，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液的ph為ph為6.8-7.3。

98、可選地，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液與所述疏水層析柱的體積比為3-6：1，優(yōu)選為4-6：1。

99、可選地，平衡處理之前，所述疏水層析還包括以下步驟：采用堿液對所采用的疏水層析柱進(jìn)行消毒處理。

100、可選地，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行消毒處理時(shí)，所用堿液為氫氧化鈉溶液。

101、可選地，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行消毒處理時(shí)，所用堿液的濃度為0.5-1.0mol/l，優(yōu)選為0.6-1.0mol/l。

102、可選地，對所采用的疏水層析柱進(jìn)行消毒處理時(shí)，所用堿液與所述陽離子交換層析柱的體積比為2-4：1，優(yōu)選為3-4：1。

103、可選地，上樣之后，所述疏水層析還包括以下步驟：采用平衡液對所述疏水層析柱進(jìn)行平衡處理。

104、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液為含無機(jī)鹽的磷酸緩沖液。

105、可選地，所述無機(jī)鹽選自硫酸銨或氯化鈉。

106、可選地，當(dāng)所述無機(jī)鹽選自硫酸銨時(shí)，對所述疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液中，所述硫酸銨的濃度為0.4-0.7mol/l，優(yōu)選為0.5-0.6mol/l。

107、可選地，當(dāng)所述無機(jī)鹽選自氯化鈉時(shí)，對所述疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液中，所述氯化鈉的濃度為1.3-1.7mol/l，優(yōu)選為1.4-1.6mol/l。

108、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液中，磷酸的濃度為15-25mmol/l，優(yōu)選為18-25mmol/l。

109、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液的ph為6.8-7.3，優(yōu)選為6.9-7.3。

110、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行平衡處理時(shí)，所用平衡液與所述疏水層析柱的體積比為4-7：1，優(yōu)選為5-7：1。

111、可選地，平衡處理之后，所述疏水層析還包括以下步驟：采用再生液對所述疏水層析柱進(jìn)行再生處理。

112、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行再生處理時(shí)，所用再生液為磷酸緩沖液。

113、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行再生處理時(shí)，所用再生液的ph為6.8-7.3，優(yōu)選為6.8-7.5。

114、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行再生處理時(shí)，所用再生液中，磷酸的濃度為15-25mmol/l，優(yōu)選為18-25mmol/l。

115、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行再生處理時(shí)，所用再生液與所述疏水層析柱的體積比為2-4：1，優(yōu)選為3-4：1。

116、可選地，再生之后，所述疏水層析還包括以下步驟：采用堿液對所述疏水層析柱進(jìn)行消毒。

117、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行消毒時(shí)，所用堿液為氫氧化鈉溶液。

118、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行消毒時(shí)，所用堿液的濃度為0.5-1.0mol/l，優(yōu)選為1.0mol/l。

119、可選地，對所述疏水層析柱進(jìn)行消毒時(shí)，所用堿液與所述疏水層析柱的體積比為2-4：1，優(yōu)選為3-4：1。

120、第二個(gè)方面，本技術(shù)還提供一種重組透明質(zhì)酸酶生產(chǎn)方法，所述重組透明質(zhì)酸酶生產(chǎn)方法包括如上所述的重組透明質(zhì)酸酶純化方法。

121、本發(fā)明的有益效果：

122、本技術(shù)采用陽離子交換層析替代復(fù)合層析和親和層析，避免了復(fù)合層析采用羥基磷灰石填料所帶來的使用壽命短、裝柱困難等問題及親和層析所帶來的無法有效分離目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)等問題，進(jìn)而提升了蛋白收率和成品純度，并將陽離子交換層析設(shè)置成位于陰離子交換層析之后、疏水層析之前即將疏水層析調(diào)整至末位即最后一道工序，避免了疏水層析后陽離子層析上樣過程中需對樣品進(jìn)行高倍數(shù)稀釋所帶來的上樣時(shí)間長，稀釋倍數(shù)不夠所致目標(biāo)蛋白未完全吸附于填料上，目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)的分離不理想，蛋白收率和成品純度較低等問題，進(jìn)而進(jìn)一步提升了蛋白收率和成品純度。

123、本技術(shù)通過選用具有高結(jié)合載量和小粒徑(即具有較高比表面積)特性的capto?simpact填料作為陽離子交換層析的填料，能夠利用capto?s?impact填料的高結(jié)合載量特性高效去除樣品中聚集體等雜質(zhì)，并利用capto?s?impact填料的小粒徑特性(即高比表面積)提高樣品中目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)的分離效果，進(jìn)而提升蛋白收率和成品純度。

124、本技術(shù)通過選用以細(xì)顆粒高剛性瓊脂糖為基架配合疏水性較強(qiáng)的苯基基團(tuán)的diamond?phenyl?mustang填料或captoppenylimpres填料作為疏水層析填料，能夠利用diamond?phenyl?mustang填料分辨率、疏水性高的特性改善填料對目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的吸附性能，進(jìn)而提升蛋白收率和成品純度。

125、本技術(shù)通過限定陰離子交換層析和陽離子交換層析步驟上樣過程中樣品的電導(dǎo)率處于特定水平(分別為小于11.5ms/cm和小于8.5ms/cm)，能夠提高填料與目標(biāo)蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)而提升蛋白收率和成品純度。

126、本技術(shù)通過限定陽離子交換層析步驟上樣過程中樣品的ph處于特定水平(即ph在4.8-5.2范圍內(nèi))，能夠提高填料與目標(biāo)蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)而提升蛋白收率和成品純度。

127、本技術(shù)通過限定疏水層析步驟上樣過程中無機(jī)鹽含量處于特定水平(即樣品中無機(jī)鹽的濃度在0.4-0.7mol/l范圍內(nèi))，能夠提高填料與雜質(zhì)的結(jié)合能力，進(jìn)而提升蛋白收率和成品純度。