本發(fā)明屬于生物，具體來(lái)說(shuō)是一種使用無(wú)標(biāo)記rnase?h探針和lc-ms對(duì)mrna進(jìn)行加帽率分析的方法。

背景技術(shù)：

1、mrna作為攜帶遺傳信息的分子，在蛋白質(zhì)合成中起著關(guān)鍵作用。mrna治療的基本原理是通過(guò)將體外合成的mrna遞送至細(xì)胞內(nèi)，指導(dǎo)細(xì)胞合成特定蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)治療或預(yù)防疾病的目的。這種技術(shù)利用人體細(xì)胞直接在體內(nèi)表達(dá)蛋白，因此具有更高的有效性和更低的副作用。其具有多種應(yīng)用，包括針對(duì)由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(sars-cov-2)引起的冠狀病毒病的疫苗，以及其他傳染病候選疫苗、癌癥免疫療法、基因編輯治療和蛋白質(zhì)替代療法。mrna療法是一種新興的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，具有巨大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。

2、盡管mrna治療具有諸多優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景，但仍面臨一些技術(shù)挑戰(zhàn)，如mrna的穩(wěn)定性、遞送效率、生產(chǎn)成本以及嚴(yán)格的監(jiān)管要求等。在mrna療法和疫苗的開(kāi)發(fā)中，mrna?5'末端的帽結(jié)構(gòu)，特別是n7甲基化鳥(niǎo)苷三磷酸帽(m7gpppg)，扮演著至關(guān)重要的角色。這一結(jié)構(gòu)不僅是mrna有效的蛋白質(zhì)翻譯所必需的，還助其逃避先天免疫監(jiān)視并調(diào)節(jié)5'介導(dǎo)的衰變，從而直接關(guān)系到療法的療效和安全性。未加帽的mrna由于無(wú)法被起始因子蛋白復(fù)合物eif4e識(shí)別，會(huì)嚴(yán)重影響其從細(xì)胞核的輸出及隨后的翻譯過(guò)程。此外，帽結(jié)構(gòu)還通過(guò)保護(hù)mrna的5'端免受核酸外切酶的降解來(lái)增強(qiáng)其穩(wěn)定性。盡管體外轉(zhuǎn)錄(ivt)技術(shù)能夠合成mrna，但合成過(guò)程中可能因酶和共轉(zhuǎn)錄加帽的不完全而導(dǎo)致最終產(chǎn)物中存在可變數(shù)量的未加帽分子。為應(yīng)對(duì)這一問(wèn)題，需要一些方法確定mrna的加帽效率，這些方法對(duì)于確?；趍rna的治療和疫苗的質(zhì)量控制至關(guān)重要。

3、鑒于mrna與帽結(jié)構(gòu)之間巨大的分子量差異，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法難以有效區(qū)分加帽與未加帽的mrna。傳統(tǒng)方法，如通過(guò)酶解mrna后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或液相色譜分析，雖能提供帽結(jié)構(gòu)信息，但多依賴(lài)于放射性標(biāo)記，操作復(fù)雜且成本高昂。此外，這些方法在區(qū)分不同帽結(jié)構(gòu)種類(lèi)時(shí)受限于色譜分辨率和保留時(shí)間，難以滿(mǎn)足快速、無(wú)標(biāo)記檢測(cè)的需求。隨著mrna療法研究的深入，開(kāi)發(fā)一種無(wú)需標(biāo)記、能夠直接表征ivt合成mrna帽結(jié)構(gòu)的方法變得尤為迫切。為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，已經(jīng)報(bào)道了使用定制設(shè)計(jì)的dna酶、核酶或dna-rna嵌合的rnase?h從mrna分子的5'端切割預(yù)定義片段的方法。dna酶可以達(dá)到特異性切割，且其穩(wěn)定性?xún)?yōu)于核酶，但dna酶活性低，酶切速率慢；核酶也可以實(shí)現(xiàn)特異性切割，但其穩(wěn)定性低，需要通過(guò)化學(xué)合成和修飾來(lái)提高其穩(wěn)定性，且無(wú)論錘頭核酶還是手槍狀核酶，其rna序列較長(zhǎng)，合成費(fèi)用高；rnase?h法為當(dāng)前工藝中最常用的方法，也是美國(guó)藥典(usp)推薦的加帽率方法，具有極大的廣譜性，可以通過(guò)dna-rna探針的設(shè)計(jì)來(lái)達(dá)到特異性切割，且穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)成本優(yōu)于核酶，由于其借助rnase?h酶來(lái)完成切割，因此酶切活性和速率優(yōu)于dna酶。使用這三種方法完成切割，5′切割片段的長(zhǎng)度為5-30nt，可以很容易地通過(guò)變性凝膠電泳或液相色譜法進(jìn)行分析。已經(jīng)報(bào)道的用dna-rna探針介導(dǎo)rnase?h測(cè)定加帽率方法中，使用的dynabeads?myone?streptavidin?c1磁珠昂貴，經(jīng)濟(jì)成本大，且磁珠純化步驟繁瑣，耗時(shí)，檢測(cè)效率低，很難滿(mǎn)足企業(yè)工藝開(kāi)發(fā)樣品檢測(cè)需求。因此，開(kāi)發(fā)一種精確、低成本且高效簡(jiǎn)單的mrna加帽率檢測(cè)方法成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。這不僅有助于提升mrna療法的質(zhì)量控制水平，也為推動(dòng)mrna藥物與疫苗的商業(yè)化進(jìn)程提供了重要技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、1.發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題

2、本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有的加帽率分析難以滿(mǎn)足快速、無(wú)標(biāo)記檢測(cè)的需求的問(wèn)題。

3、2.技術(shù)方案

4、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

5、本發(fā)明的一種使用無(wú)標(biāo)記rnase?h探針和lc-ms對(duì)mrna進(jìn)行加帽率分析的方法，所述方法包括如下步驟：

6、s100、體外轉(zhuǎn)錄制備不加帽rna，rna長(zhǎng)度＞4000nt；

7、s200、體外轉(zhuǎn)錄制備加帽rna，rna長(zhǎng)度＞4000nt；

8、s300、將步驟s100、s200中的產(chǎn)物純化得到待測(cè)rna；

9、s400、根據(jù)待測(cè)rna的5’utr序列設(shè)計(jì)rnase?h探針；

10、s500、將步驟s300的待測(cè)rna與步驟s400中的rnase?h探針變性、退火得到雜合序列；

11、s600、利用rna水解酶識(shí)別切割雜合序列，得到混合切割片段；

12、s700、將步驟s600中的混合切割片段經(jīng)過(guò)硅膠柱進(jìn)行片段大小篩選，得到含有目的片段的混合短片段；

13、s800、將步驟s700中的混合短片段進(jìn)行l(wèi)c-ms分析，計(jì)算得到加帽率。

14、優(yōu)選地，所述步驟s100和步驟s200中的rna為mrna。

15、優(yōu)選地，所述步驟s100中的不加帽rna通過(guò)t7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制備。

16、優(yōu)選地，所述步驟s200中的加帽rna的帽狀結(jié)構(gòu)為cap?0、capⅰ、capⅱ型結(jié)構(gòu)中的一種；所述加帽rna通過(guò)酶法加帽或者共轉(zhuǎn)錄加帽制備。

17、優(yōu)選地，所述步驟s300中的純化方式為磁珠純化、柱純化、酚/氯仿純化或氯化鋰純化。

18、優(yōu)選地，所述步驟s400中的待測(cè)rna?5’utr為rna自5’序列開(kāi)始第1～53nt堿基序列；所述探針形式為rna片段10～20nt+dna片段4～6nt，rnase?h探針無(wú)任何修飾，所述待測(cè)rna與rnase?h探針的比例為1：1～1：10。

19、優(yōu)選地，所述步驟s500中變性為在85～95℃變性1～10min；所述退火為依次在65℃持續(xù)2min、55℃持續(xù)2min、45℃持續(xù)2min、37℃持續(xù)2min、30℃持續(xù)2min、22℃持續(xù)2min。

20、優(yōu)選地，所述步驟s600中的rna水解酶為rnase?h、rnase?hⅰ和rnase?hⅲ中的一種；所述rna水解酶反應(yīng)溫度為20～37℃，反應(yīng)時(shí)間為0～3h。

21、優(yōu)選地，所述步驟s600中的混合切割片段包括未參與反應(yīng)的全長(zhǎng)rna、長(zhǎng)3’切割產(chǎn)物、加帽的短5’切割產(chǎn)物、未加帽的短5’切割產(chǎn)物和rnase?h探針。

22、優(yōu)選地，所述步驟s700中所述的混合短片段為加帽的短5’切割產(chǎn)物、未加帽的短5’切割產(chǎn)物和rnase?h探針。

23、3.有益效果

24、采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

25、本發(fā)明的一種使用無(wú)標(biāo)記rnase?h探針和lc-ms對(duì)mrna進(jìn)行加帽率分析的方法，包括如下步驟：s100、體外轉(zhuǎn)錄制備不加帽rna，rna長(zhǎng)度＞4000nt；s200、體外轉(zhuǎn)錄制備加帽rna，rna長(zhǎng)度＞4000nt；s300、將步驟s100、s200中的產(chǎn)物純化得到待測(cè)rna；s400、根據(jù)待測(cè)rna的5’utr序列設(shè)計(jì)rnase?h探針；s500、將步驟s300的待測(cè)rna與步驟s400中的rnase?h探針變性、退火得到雜合序列；s600、利用rna水解酶識(shí)別切割雜合序列，得到混合切割片段；s700、將步驟s600中的混合切割片段經(jīng)過(guò)硅膠柱進(jìn)行片段大小篩選，得到含有目的片段的混合短片段；s800、將步驟s700中的混合短片段進(jìn)行l(wèi)c-ms分析，計(jì)算得到加帽率。本發(fā)明的方案根據(jù)待檢測(cè)rna序列設(shè)計(jì)dna-rna探針，利用rnase?h的特異性切割rna分子，通過(guò)硅膠柱的特異性吸附分離出短片段，并利用lc-ms的方法檢測(cè)剪切后的rna產(chǎn)物的分子量大小以及相對(duì)比例，從而測(cè)定加帽效率，實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)rna加帽效率，能夠避免放射性污染，且操作簡(jiǎn)單、成本低。