本發(fā)明屬于分子生物學的基因診斷和治療，尤其涉及特發(fā)性肺纖維化相關分子靶點的篩選方法及應用。

背景技術：

1、肺纖維化是一種彌漫性間質性肺疾病，由多種病因因素的協(xié)同作用引起。該疾病的病理特征包括肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞增殖、巨噬細胞活化、細胞外基質的過度沉積和肺組織結構的破壞。衰老、遺傳易感性、環(huán)境因素(如吸煙、職業(yè)暴露、空氣污染、吸入微量元素、病毒感染)、已知和未知原因的重復抗原刺激以及結締組織疾病都可導致肺組織損傷和引發(fā)肺纖維化的慢性炎癥。

2、肺纖維化常導致嚴重的肺功能損害，并不可逆地發(fā)展，直到它到達終末期，其特征是肺功能的完全喪失。特發(fā)性肺纖維化(ipf)是一種慢性進行性間質性肺疾病，病因不明，主要影響60歲或以上的個體，被認為是一種老年疾病。與許多惡性腫瘤相比，ipf患者預后很差，死亡率更高，由于有效的治療方法有限，ipf通常被稱為“腫瘤樣疾病”。目前，全球約有300萬患者被診斷為ipf。這些數(shù)字正以每年11％的速度增長，這對全球公共衛(wèi)生構成了重大威脅。

3、肺纖維化的治療引起了臨床的廣泛關注，是肺部疾病研究領域的一個突出課題。然而，到目前為止，這一領域的進展有限，肺移植實際上仍然是唯一有效的方法?？估w維化治療主要包括消除致病菌，抑制參與細胞外基質(ecm)合成的細胞活化，并促進ecm降解。目前，尼達尼和吡非尼酮是全球唯一批準用于治療ipf的藥物干預。雖然尼特達尼布和吡非尼酮可以部分減輕某些患者的肺功能下降，但它們在有效阻止纖維化進展方面的療效仍然有限，往往導致由于藥物不良反應而停止治療。因此，在臨床實踐中開發(fā)安全有效的抗纖維化藥物勢在必行。在藥物治療方面缺乏重大突破的情況下，間充質干細胞及其衍生物等生物干預具有巨大的潛力；然而，關于其療效仍有一個爭論的話題。

4、微波治療的最新進展已經(jīng)顯示出了通過特異性靶向ecm動力學來治療纖維化疾病的前景。微波照射可提高局部組織溫度，增強血液循環(huán)，促進免疫反應，導致ecm成分的調節(jié)。研究表明，微波治療可以減少ecm的關鍵成分膠原沉積，并在肺纖維化動物模型中改善肺功能。這些發(fā)現(xiàn)表明，微波治療不僅減輕炎癥，而且直接影響ecm的病理重構，這在纖維化的進展中是至關重要的。然而，目前的研究尚未探討微波照射對肺纖維化(pf)的生物學作用機制。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本技術提供了特發(fā)性肺纖維化相關分子靶點的篩選方法及應用，通過分析轉錄組學和代謝組測序數(shù)據(jù)來確定暴露于微波照射下的大鼠肺纖維化(pf)發(fā)展的重要基因和代謝物。并使用生物信息學技術來檢查與這些基本基因相關的生物途徑，并研究它們的調控網(wǎng)絡，為臨床干預提供理論支持和參考。

2、第一方面，本發(fā)明提供了特發(fā)性肺纖維化相關分子靶點的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟：

3、步驟1：構建肺動脈纖維化大鼠模型，并分為對照組、模型組、低功率微波照射組和高功率微波照射組；

4、步驟2：對照組和模型組不予微波照射治療，低功率微波照射組和高功率微波照射組則在造模后第21天開始微波照射5天；第26天對大鼠進行安樂死，犧牲大鼠后，收集對照組、模型組、低功率微波照射組和高功率微波照射組的肺組織樣本進行轉錄組學和代謝組學測序；

5、步驟3：轉錄組測序和數(shù)據(jù)預處理；

6、步驟4：代謝組測序和數(shù)據(jù)預處理；

7、步驟5：從公共數(shù)據(jù)庫中挖掘數(shù)據(jù)；

8、步驟6：對轉錄組測序數(shù)據(jù)和代謝組測序數(shù)據(jù)進行聚類分析；

9、步驟7：對轉錄組測序數(shù)據(jù)和代謝組測序數(shù)據(jù)進行差異表達分析；

10、步驟8：對步驟7獲得的差異表達基因進行富集分析，確定候選基因和候選代謝物；

11、步驟9：通過候選基因與候選代謝物之間的相關性分析，鑒定樞紐基因和關鍵代謝產物，并分析樞紐基因的分子調控機制；

12、步驟10：確定特發(fā)性肺纖維化中的關鍵基因；

13、步驟11：利用磷酸化硅酸化plus分析關鍵基因的翻譯后修飾類型和相關位點。

14、在該方面的部分優(yōu)選例中，步驟2在微波照射治療過程中，低功率微波照射組：90v/m，20min/d；高功率微波照射組：250v/m，微波照射20min/d。

15、在該方面的部分優(yōu)選例中，步驟7中將四組的差異表達基因結合識別公共差異表達基因，通過公共差異表達基因與趨勢變化基因重疊確定1481個候選基因，對候選基因進行go和kegg富集分析，在752個go項和31個kegg通路中顯著富集；并通過將公共差異表達基因與趨勢變化代謝物重疊確定8個候選基因，對候選代謝物進行kegg富集分析，在5個kegg途徑中富集。

16、在該方面的部分優(yōu)選例中，步驟9中對候選基因與候選代謝物通過相關性分析，共鑒定出18個樞紐基因和5個關鍵代謝產物，樞紐基因包括ccl7、cd163、lilrb2、socs3、vstm1、血清蛋白1、ndufs5、izumo1r、np4、per3、nr1d1、nr1d2、tef、loc100912450、fam169b、lrrc39、ms4a4a和satb1；關鍵代謝產物為西替利嗪正氧化物、抗壞血酸、天冬氨酸-l-脯氨酸、ni3400000和戊二酸。

17、在該方面的部分優(yōu)選例中，將18個樞紐基因提交到檢索相互作用基因/蛋白數(shù)據(jù)庫中，置信度閾值設置為0.15，獲得11個具有蛋白質相互作用的基因；利用mirdb和mirwalk預測靶向18個樞紐基因的mirna，通過重疊兩個數(shù)據(jù)庫中預測的mirnas確定24個關鍵mirnas；通過將11個蛋白相互作用基因與24個關鍵mirnas相交，建立了一個由35個節(jié)點和42條邊組成的蛋白相互作用基因-關鍵mirna網(wǎng)絡。

18、在該方面的部分優(yōu)選例中，步驟10中分別對gse166036和gse72073數(shù)據(jù)集進行差異表達分析，將得出的兩組差異表達基因和樞紐基因的重合部分確定特發(fā)性肺纖維化中的關鍵基因，關鍵基因為cd163和per3。

19、第二方面，本發(fā)明提供了選擇下列基因的一種或者組合作為特發(fā)性肺纖維化診斷標志物的用途，其中，所述基因包括：cd163和per3。

20、第三方面，本發(fā)明提供選擇下列基因的一種或者組合作為特發(fā)性肺纖維化預防和/或治療靶點的用途，其中，所述基因包括：cd163和per3。

21、在該方面的一個優(yōu)選例中，通過抑制cd163和/或per3基因的表達水平，發(fā)揮治療特發(fā)性肺纖維化的作用。

22、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

23、本發(fā)明通過聚類分析、差異表達分析和相關性分析，確定了樞紐基因和關鍵代謝物，并通過gse166036和gse72073數(shù)據(jù)集的差異表達分析結果與重疊的樞紐基因確定關鍵基因，分別為cd163和per3，對這兩個關鍵基因進行基因表達分析、功能分析和翻譯后修飾(ptm)分析，顯示這兩個關鍵基因在微波輻射治療肺纖維化的干預中發(fā)揮關鍵作用，為開發(fā)ipf的靶向治療提供了潛在的理論基礎。