本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種牛分枝桿菌（ mycobacterium?bovis, m.bovis）非編碼小rna及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（ mycobacterium?tuberculosis?complex， mtbc）感染引起的慢性消耗性疾病。包括人在內(nèi)的幾乎所有脊椎動(dòng)物都易感，是單一病原感染致死率最高和全球最主要的傳染病之一。結(jié)核病的全球防控迫在眉睫。

2、致病機(jī)制不清晰是制約結(jié)核病防控的重要原因，牛分枝桿菌（ mycobacterium? bovis, m.bovis）是結(jié)核分枝桿菌（ mycobacterium?tuberculosis, m.tb）牛變種，其體外傳代致弱的疫苗株牛分枝桿菌卡介苗（bcg）與結(jié)核分枝桿菌基因組相似性高達(dá)99.9%，感染譜相互交叉，常用作結(jié)核分枝桿菌的模式菌。因此，深入解析牛分枝桿菌的毒力相關(guān)因子及其致病機(jī)制，是結(jié)核病新型藥物研制的重要基礎(chǔ)。

3、在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，牛分枝桿菌在一系列的逆境壓力條件下不斷通過(guò)各種調(diào)節(jié)機(jī)制適應(yīng)這些逆境環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)了與宿主的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，同時(shí)對(duì)藥物耐受能力不斷提升。因此，深入挖掘牛分枝桿菌適應(yīng)逆境的分子機(jī)制，確定影響牛分枝桿菌感染、致病及擴(kuò)散、耐藥的關(guān)鍵因子，是開(kāi)發(fā)結(jié)核病新型診斷試劑、疫苗和藥物的重要途徑。

4、細(xì)菌基因組dna約93%能被轉(zhuǎn)錄為rna，其中僅有極少數(shù)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能被翻譯為蛋白質(zhì)，余下的不能被翻譯為蛋白質(zhì)的都屬于非編碼rna(non-coding?rna,?ncrna)。非編碼rna可分為非編碼大rna和非編碼小rna。其中，非編碼小rna（small?rna,?srna）是一類(lèi)長(zhǎng)度在20～300nt的rna，這些rna在調(diào)控基因表達(dá)、調(diào)控細(xì)胞周期、維持基因組穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用。

5、在目前結(jié)核病耐藥菌嚴(yán)重的嚴(yán)峻形勢(shì)下，尋找結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中具有調(diào)控逆境能力、影響細(xì)菌致病性（包括黏附、侵襲能力、胞內(nèi)存活能力、生長(zhǎng)速度等）、改變細(xì)菌耐藥性等多種表型的srna，將有助于提高我們對(duì)結(jié)核病致病機(jī)理及宿主防御機(jī)制的了解，并為結(jié)核病診斷和臨床治療提供依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是提供一種新的牛分枝桿菌非編碼小rna，該非編碼小rna能調(diào)控牛分枝桿菌的逆境適應(yīng)能力，改變細(xì)菌的致病性和抗性，具有成為結(jié)核病新型診斷試劑、疫苗和藥物靶標(biāo)的潛力。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，申請(qǐng)人所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家動(dòng)物結(jié)核病專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室（武漢）對(duì)牛分枝桿菌（卡介苗東京株）感染巨噬細(xì)胞thp-1后的胞內(nèi)及胞外菌的總rna進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，利用6種壓力模型對(duì)胞內(nèi)及胞外菌中差異表達(dá)的ncrna進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)14個(gè)srna在不同壓力模型下的表達(dá)發(fā)生顯著的變化。

3、其中，一個(gè)被命名為ncbcg427的非編碼小rna已于2021年9月30日申請(qǐng)專(zhuān)利，專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)cn?113862267?a。

4、本發(fā)明提供的另一個(gè)非編碼小rna，申請(qǐng)人將其命名為ncbcg201，只在胞外菌中存在且在六種壓力條件下的表達(dá)發(fā)生顯著的變化，經(jīng)鑒定該ncrna為一種新型的srna，位于bcg的基因間。

5、進(jìn)一步地，以牛分枝桿菌經(jīng)典模式菌株牛分枝桿菌卡介苗東京株（mycobacteriumbovis?bacille?calmette-guérin， bcg）為模板，構(gòu)建ncbcg201過(guò)表達(dá)菌株。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)菌株在碳饑餓培養(yǎng)條件下的存活能力明顯增強(qiáng)，在膜壓力培養(yǎng)條件下的存活能力明顯下降，說(shuō)明ncbcg201基因確實(shí)對(duì)牛分枝桿菌的環(huán)境壓力具有一定調(diào)控作用。通過(guò)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ncbcg201過(guò)表達(dá)菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表現(xiàn)出更慢的生長(zhǎng)速度，更早進(jìn)入平臺(tái)期，而其它生長(zhǎng)特性如單菌落面積、褶皺和菌體形態(tài)等未發(fā)生顯著變化。生物被膜形成能力的測(cè)定結(jié)果表明，ncbcg201過(guò)表達(dá)菌株的生物被膜成膜能力顯著降低。

6、鑒于生物被膜是細(xì)菌對(duì)抗生素、惡劣環(huán)境及宿主免疫防御機(jī)制產(chǎn)生抗性和導(dǎo)致細(xì)菌性疾病難以根治的重要原因，因此本發(fā)明提供的非編碼小rna在降低牛分枝桿菌的致病性和抗性方面具有很好的應(yīng)用前景。

7、本發(fā)明進(jìn)一步提供一種含有所述非編碼小rna的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒用于構(gòu)建過(guò)表達(dá)所述非編碼小rna的重組牛分枝桿菌。

8、本發(fā)明還提供一種過(guò)表達(dá)所述非編碼小rna的重組牛分枝桿菌，該重組牛分枝桿菌可用于制備牛結(jié)核病疫苗。

9、本發(fā)明還提供一種降低牛分枝桿菌抗性的方法，使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使所述的非編碼小rna在牛分枝桿菌中過(guò)表達(dá)。

10、本發(fā)明對(duì)ncbcg201的發(fā)現(xiàn)及其功能確定，對(duì)闡明牛分枝桿菌甚至結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的致病機(jī)制，以及開(kāi)發(fā)新型診斷試劑、疫苗和藥物都具有極為重要的參考價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種牛分枝桿菌（mycobacterium?bovis,?m.bovis）非編碼小rna，其核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

2.含有權(quán)利要求1所述非編碼小rna的重組質(zhì)粒。

3.過(guò)表達(dá)權(quán)利要求1所述非編碼小rna的重組牛分枝桿菌。

4.權(quán)利要求3所述的重組牛分枝桿菌在制備牛結(jié)核病疫苗中的應(yīng)用。

5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述重組牛分枝桿菌在膜壓力條件下的存活能力下降，生物被膜的成膜能力降低，更易受到宿主免疫系統(tǒng)或藥物的識(shí)別和攻擊。

6.一種降低牛分枝桿菌抗性的方法，其特征在于：使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使權(quán)利要求1所述的非編碼小rna在牛分枝桿菌中過(guò)表達(dá)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種牛分枝桿菌（Mycobacterium?bovis,M.bovis）非編碼小RNA，屬于生物領(lǐng)域。所述非編碼小RNA核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，研究發(fā)現(xiàn)，ncBCG201過(guò)表達(dá)BCG菌株在碳饑餓培養(yǎng)條件下的存活能力明顯增強(qiáng)，在膜壓力培養(yǎng)條件下的存活能力明顯下降，過(guò)表達(dá)菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表現(xiàn)出更慢的生長(zhǎng)速度，且生物被膜成膜能力顯著降低。以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的非編碼小RNA能降低牛分枝桿菌的致病性和抗性，在制備牛結(jié)核病疫苗方面具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：陳穎鈺,杜澤錦,郭愛(ài)珍,章愷倫,翟文俊,陳建國(guó),陳曦,胡長(zhǎng)敏,張磊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15