本發(fā)明涉及一種分析方法，具體說是涉及dna單核苷酸多態(tài)性分型的方法。
背景技術：
1、單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，snp)是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)。人類基因組中的發(fā)生頻率較高，平均大約每1000個堿基中就有一個snp位點，一個人的基因組dna大約有五百萬個snp位點。目前的研究表明，大部分snp對人類健康或生長發(fā)育沒有影響，但有些snp位點會影響基因的功能，進而導致生物性狀的改變、疾病的發(fā)生、藥物的耐受和環(huán)境的易感。因此，snp分型分析是疾病風險評估、個體藥物反應預測、疾病基因的起源和遷移等方面有重要的價值，被廣泛應用于科學研究和臨床檢測中。
2、目前，常用的基因分析方法主要依賴于pcr反應構建，包括測序法、taqman探針法、芯片法和質譜法。crispr/cas12a檢測體系因具有高靈敏度、高特異性、可編程性、耗時短和反應溫和等優(yōu)勢，已快速發(fā)展為新一代核酸檢測技術。crispr/cas12a檢測體系是通過crrna引導識別目標dna而觸發(fā)cas12a蛋白的反式裂解活性，對兩端分別標記熒光基團和淬滅基團的短dna單鏈進行水解，產生熒光信號而實現目標dna的檢測。然而，由于cas12a蛋白的反式裂解活性的非特異性，crispr/cas12a檢測體系在2個及以上目標物同時分析時遇到困難。通常情況下，一個snp位點有3個基因型(野生型、突變型、雜合型)。因此，crispr/cas12a檢測體系很難進行一鍋法snp基因分型，常需要依賴其他技術(例如微流控技術)的輔助來完成，較為復雜?？梢姡_發(fā)一鍋法crispr/cas12a實現snp基因分型可以簡化檢測步驟，降低成本，具有很大的應用價值和商業(yè)前景。
3、本發(fā)明基于crispr/cas12a檢測體系，針對野生型和突變型的序列，設計一對flapprimer引物，在其5’端引入18-21個核苷酸，通過fen1酶作用獲得5’端產物p1和p2，作為sda擴增的觸發(fā)引物；通過sda擴增將單核苷酸多態(tài)性信息快速轉換成2種不同擴增產物t1和t2；根據t1和t2的序列分別設計crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應體系的引導鏈，進而通過熒光信號的“強”和“弱”可實現單核苷酸多態(tài)性的分型。
技術實現思路
1、本發(fā)明的目的正是基于fen1-sda-crispr/cas12a多重信號放大系統(tǒng)構建單核苷酸多態(tài)性快速分型方法。
2、本發(fā)明的目的可通過下述技術措施來實現：
3、本發(fā)明是一種基于fen1-sda-crispr/cas12a多重信號放大的單核苷酸多態(tài)性快速分型方法，通過crispr/cas12a反應體系熒光信號“強”和“弱”，實現單核苷酸多態(tài)性的分型，其特征在于：所述單核苷酸多態(tài)性快速分型新方法包含識別、轉換和檢測3個步驟；其中所述識別步驟是根據野生型和突變型的序列設計flap?primer?1、flap?primer?2和invading?primer，在fen1酶的作用下可分別產生2種不同的5’端酶切產物p1和p2；其中所述轉換步驟是根據p1和p2的序列設計2條不同的sda擴增模板，酶切產物p1和p2觸發(fā)sda擴增實現單核苷酸多態(tài)性信息快速轉換成2種不同擴增產物t1和t2；其中所述檢測步驟是根據t1和t2的序列分別設計crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應體系的引導鏈，通過熒光信號的“強”和“弱”可實現單核苷酸多態(tài)性的分型。
4、本發(fā)明具有以下有益效果：
5、本發(fā)明是一種基于fen1-sda-crispr/cas12a多重信號放大的單核苷酸多態(tài)性快速分型方法，包含識別、轉換和檢測3個步驟；所述識別步驟是根據野生型和突變型的序列設計flap?primer?1、flap?primer?2和invading?primer，在fen1酶的作用下可分別產生2種不同的5’端酶切產物p1和p2，保證所有snp位點均可以使用本發(fā)明的方法進行基因分型，保證了單核苷酸多態(tài)性分型的普適性。
6、本發(fā)明的轉換步驟是根據p1和p2的序列設計2條不同的sda擴增模板，酶切產物p1和p2觸發(fā)sda擴增高效率獲得2種不同擴增產物t1和t2，不僅實現單核苷酸多態(tài)性信息的快速轉換，還可以通過擴增放大降低樣本量的要求，實現痕量檢測。
7、本發(fā)明在crispr/cas12a檢測階段，針對sda擴增產物t1和t2的序列特征分別設計了crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應體系的引導鏈，通過crrna1和crrna2的濃度控制，不僅保證了單核苷酸多態(tài)性分型的特異性，還可以根據熒光信號的“強”和“弱”可實現單核苷酸多態(tài)性的分型。
8、本發(fā)明通過flap?primer、sda模板、crrna的設計，以及crrna1和crrna2的濃度控制，解決了crispr/cas12a反應體系在單核苷酸多態(tài)性分型的普適性、特異性和高效性，無需其他技術輔助即可即可實現crispr/cas12a系統(tǒng)的snp基因分型，節(jié)省了檢測時間，降低了檢測成本，可廣泛應用到科研和臨床實驗室，具有廣闊的市場前景。
1.一種基于fen1-sda-crispr/cas12a多重信號放大的單核苷酸多態(tài)性快速分型方法，包含識別、轉換和檢測3個步驟，通過crispr/cas12a反應體系熒光信號的“強”和“弱”判斷，實現單核苷酸多態(tài)性的分型分析，其特征在于：所述識別步驟是根據野生型和突變型的序列設計flap?primer?1、flap?primer2和invading?primer，在fen1酶的作用下可分別產生2種不同的5’端酶切產物p1和p2；其中所述轉換步驟是根據p1和p2的序列設計2條不同的sda擴增模板，酶切產物p1和p2觸發(fā)sda擴增實現單核苷酸多態(tài)性信息快速轉換成2種不同擴增產物t1和t2；其中所述檢測步驟是根據sda擴增產物t1和t2的序列分別設計crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應體系的引導鏈，通過熒光信號的“強”和“弱”可實現單核苷酸多態(tài)性的分型。
2.根據權利要求1所述的flap?primer?1和flap?primer?2，其特征在于：目標位點的5’端長度為18-21個核苷酸，且flap?primer?1和flap?primer?2在目標位點-3到-1位的序列不同。
3.根據權利要求1所述的sda擴增模板，其特征在于：sda擴增模板包含5’段、中段和3’段，其中5’段為擴增模板，中段序列包含2個nb.bbvci酶切位點，3’段和fen1酶切的5’端產物互補。
4.根據權利要求1所述的crrna1和crrna2，其特征在于：crrna1和crrna2分別用于靶向sda擴增產物t1和t2，crrna1和crrna2在crispr/cas12a反應體系中的濃度有較大差別且應小于cas12a蛋白濃度的1/2。