本發(fā)明涉及一種分析方法，具體說是涉及dna單核苷酸多態(tài)性分型的方法。
背景技術(shù)：
1、單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide?polymorphism，snp)是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)。人類基因組中的發(fā)生頻率較高，平均大約每1000個(gè)堿基中就有一個(gè)snp位點(diǎn)，一個(gè)人的基因組dna大約有五百萬個(gè)snp位點(diǎn)。目前的研究表明，大部分snp對(duì)人類健康或生長(zhǎng)發(fā)育沒有影響，但有些snp位點(diǎn)會(huì)影響基因的功能，進(jìn)而導(dǎo)致生物性狀的改變、疾病的發(fā)生、藥物的耐受和環(huán)境的易感。因此，snp分型分析是疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、個(gè)體藥物反應(yīng)預(yù)測(cè)、疾病基因的起源和遷移等方面有重要的價(jià)值，被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床檢測(cè)中。
2、目前，常用的基因分析方法主要依賴于pcr反應(yīng)構(gòu)建，包括測(cè)序法、taqman探針法、芯片法和質(zhì)譜法。crispr/cas12a檢測(cè)體系因具有高靈敏度、高特異性、可編程性、耗時(shí)短和反應(yīng)溫和等優(yōu)勢(shì)，已快速發(fā)展為新一代核酸檢測(cè)技術(shù)。crispr/cas12a檢測(cè)體系是通過crrna引導(dǎo)識(shí)別目標(biāo)dna而觸發(fā)cas12a蛋白的反式裂解活性，對(duì)兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的短dna單鏈進(jìn)行水解，產(chǎn)生熒光信號(hào)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)dna的檢測(cè)。然而，由于cas12a蛋白的反式裂解活性的非特異性，crispr/cas12a檢測(cè)體系在2個(gè)及以上目標(biāo)物同時(shí)分析時(shí)遇到困難。通常情況下，一個(gè)snp位點(diǎn)有3個(gè)基因型(野生型、突變型、雜合型)。因此，crispr/cas12a檢測(cè)體系很難進(jìn)行一鍋法snp基因分型，常需要依賴其他技術(shù)(例如微流控技術(shù))的輔助來完成，較為復(fù)雜。可見，開發(fā)一鍋法crispr/cas12a實(shí)現(xiàn)snp基因分型可以簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟，降低成本，具有很大的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)前景。
3、本發(fā)明基于crispr/cas12a檢測(cè)體系，針對(duì)野生型和突變型的目標(biāo)dna片段，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，在引物的5’端引入crispr/cas12a的pam識(shí)別序列tttn，擴(kuò)增產(chǎn)物可被crispr/cas12a檢測(cè)；針對(duì)野生型和突變型的擴(kuò)增產(chǎn)物分別設(shè)計(jì)crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應(yīng)體系的引導(dǎo)鏈；設(shè)計(jì)新型功能化單鏈dna報(bào)告探針reporter，其兩端序列和crrna2的非目標(biāo)識(shí)別區(qū)互補(bǔ)可抑制crrna2的活性，與crrna2結(jié)合后在單鏈dna中間形成突起，該突起的兩端分別修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，用作crispr/cas12a檢測(cè)體系的報(bào)告探針；通過野生型、突變型、雜合型產(chǎn)生熒光信號(hào)“有”和“無”、“強(qiáng)”和“弱”的邏輯判斷，實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型分析。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的正是基于crispr/cas12a反應(yīng)體系的特點(diǎn)開發(fā)一種熒光信號(hào)邏輯門方法實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性分型。
2、本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)：
3、本發(fā)明是一種基于crispr/cas12a邏輯門的單核苷酸多態(tài)性分型方法，通過crispr/cas12a反應(yīng)體系熒光信號(hào)“有”和“無”、“強(qiáng)”和“弱”的邏輯門輸入，實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型輸出，其特征在于：所述單核苷酸多態(tài)性分型新方法包括目標(biāo)片段擴(kuò)增和crispr/cas12a檢測(cè)兩個(gè)步驟；其中所述目標(biāo)片段擴(kuò)增是通過擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)在目標(biāo)位點(diǎn)的-15到-11位引入crispr/cas12a的pam識(shí)別序列tttn，擴(kuò)增產(chǎn)物可被crispr/cas12a檢測(cè)；其中所述crispr/cas12a檢測(cè)是應(yīng)用2條能夠區(qū)分野生型和突變型擴(kuò)增產(chǎn)物的crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應(yīng)體系的引導(dǎo)鏈；其中所述crispr/cas12a檢測(cè)使用新型功能化單鏈dna報(bào)告探針，其特征在于：?jiǎn)捂渄na兩端序列和crrna2的非目標(biāo)識(shí)別區(qū)互補(bǔ)，與crrna2結(jié)合后在單鏈dna中間形成突起，該突起的兩端分別修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，用作crispr/cas12a檢測(cè)體系的報(bào)告探針，通過熒光信號(hào)的“有”和“無”、“強(qiáng)”和“弱”的邏輯門實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性分型。
4、本發(fā)明具有以下有益效果：
5、本發(fā)明是一種基于crispr/cas12a邏輯門的單核苷酸多態(tài)性分型方法，包含目標(biāo)片段擴(kuò)增和crispr/cas12a檢測(cè)兩個(gè)步驟。在目標(biāo)片段擴(kuò)增階段，通過擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)在目標(biāo)位點(diǎn)的-15到-11位引入crispr/cas12a的pam識(shí)別序列tttn，擴(kuò)增產(chǎn)物可被crispr/cas12a檢測(cè)，保證所有snp位點(diǎn)均可以使用本發(fā)明的方法進(jìn)行基因分型，保證了單核苷酸多態(tài)性分型的普適性。
6、本發(fā)明在crispr/cas12a檢測(cè)階段，針對(duì)野生型和突變型擴(kuò)增產(chǎn)物序列特征分別設(shè)計(jì)了crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應(yīng)體系的引導(dǎo)鏈，crrna1和crrna2僅在目標(biāo)位點(diǎn)處的序列不同，并且均不能與目標(biāo)位點(diǎn)的+2位互補(bǔ)，保證了單核苷酸多態(tài)性分型的特異性。
7、本發(fā)明在crispr/cas12a檢測(cè)階段，設(shè)計(jì)了一種功能化單鏈dna報(bào)告探針，其序列和crrna2的非目標(biāo)識(shí)別區(qū)互補(bǔ)，與crrna2結(jié)合后在單鏈dna中間形成突起，該突起的兩端分別修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，用作crispr/cas12a檢測(cè)體系的報(bào)告探針有以下功能：當(dāng)存在野生型擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的弱熒光信號(hào)，可判斷為野生型；當(dāng)不存在野生型擴(kuò)增產(chǎn)物而存在突變型擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，由于crrna2被報(bào)告探針結(jié)合抑制，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，可判斷為突變型；當(dāng)同時(shí)存在野生型和突變型的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，crrna1和crrna2均可發(fā)揮作用，產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)，可以判斷為雜合型。因此，功能化單鏈dna報(bào)告探針可以crispr/cas12a一鍋法實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性分型，解決crispr/cas12a檢測(cè)體系因cas12a蛋白反式裂解活性的非特異性導(dǎo)致多目標(biāo)物同時(shí)分析的難題。
8、本發(fā)明通過擴(kuò)增引物、crrna1、crrna2和功能化單鏈dna報(bào)告探針的設(shè)計(jì)，解決了crispr/cas12a反應(yīng)體系在單核苷酸多態(tài)性分型的普適性、特異性和高效性，可廣泛應(yīng)用到科研和臨床實(shí)驗(yàn)室，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
1.一種基于crispr/cas12a邏輯門的單核苷酸多態(tài)性分型方法，通過crispr/cas12a反應(yīng)體系熒光信號(hào)“有”和“無”、“強(qiáng)”和“弱”的邏輯判斷，實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的分型分析，其特征在于：所述單核苷酸多態(tài)性分型新方法包括目標(biāo)片段擴(kuò)增和crispr/cas12a檢測(cè)兩個(gè)步驟；其中所述目標(biāo)片段擴(kuò)增是通過擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)在目標(biāo)位點(diǎn)的-15到-11位引入crispr/cas12a的pam識(shí)別序列tttn，擴(kuò)增產(chǎn)物可被crispr/cas12a檢測(cè)；其中所述crispr/cas12a檢測(cè)是應(yīng)用2條能夠區(qū)分野生型和突變型擴(kuò)增產(chǎn)物的crrna1和crrna2作為crispr/cas12a反應(yīng)體系的引導(dǎo)鏈，設(shè)計(jì)新型功能化單鏈dna報(bào)告探針，通過熒光信號(hào)的“有”和“無”、“強(qiáng)”和“弱”的邏輯判斷實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性分型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的crrna1和crrna2，其特征在于：crrna1和crrna2分別識(shí)別野生型和突變型的擴(kuò)增產(chǎn)物，crrna1和crrna2僅在目標(biāo)位點(diǎn)處的序列不同，并且均不能與目標(biāo)位點(diǎn)的+2位互補(bǔ)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型功能化單鏈dna報(bào)告探針，其特征在于：?jiǎn)捂渄na兩端序列和crrna2的非目標(biāo)識(shí)別區(qū)互補(bǔ)，與crrna2結(jié)合后在單鏈dna中間形成突起，該突起的兩端分別修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，用作crispr/cas12a檢測(cè)體系的報(bào)告探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性分型，其特征在于：當(dāng)crispr/cas12a檢測(cè)體系沒有熒光信號(hào)時(shí)為突變型，當(dāng)crispr/cas12a檢測(cè)體系產(chǎn)生弱熒光信號(hào)時(shí)為野生型，當(dāng)crispr/cas12a檢測(cè)體系產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)時(shí)為雜合型。