本發(fā)明涉及發(fā)酵肉制品，具體領(lǐng)域?yàn)橐环N腸膜明串珠菌、重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、色澤是評(píng)估肉制品品質(zhì)的直接感官指標(biāo)。肉制品長(zhǎng)期放置會(huì)導(dǎo)致肌紅蛋白(mb)的fe2+被氧化fe3+，轉(zhuǎn)化成灰棕色的高鐵肌紅蛋白。傳統(tǒng)肉制品加工廣泛采用亞硝酸鹽來(lái)改善肉制品的色澤，通過(guò)添加亞硝酸鹽產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮與肌紅蛋白結(jié)合生成鮮紅色的亞硝基肌紅蛋白，使肉制品維持在相對(duì)穩(wěn)定的理想色澤，但亞硝酸鹽會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)致癌物——n-亞硝胺化合物，并且可能會(huì)導(dǎo)致一氧化氮中毒。為提高肉制品安全性及對(duì)天然清潔標(biāo)簽的追求，研究者迫切尋求替代亞硝酸鹽的發(fā)色方法。

2、目前，替代亞硝酸鹽的方法最廣泛的研究是利用微生物發(fā)色，這些微生物主要包括乳酸菌、葡萄球菌和微球菌等。cn109868251a公開(kāi)了一株具有發(fā)色作用的肉葡萄球菌b1-2。該發(fā)色劑為肉葡萄球菌，通過(guò)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)制成凍干型發(fā)酵劑，在薩拉米香腸中的接種量為0.01％-0.05％。使用時(shí)，在整個(gè)發(fā)酵期接種菌株組與添加60ppm的亞硝酸鹽組色度值無(wú)顯著差異，可代替亞硝酸鹽在香腸中的發(fā)色作用。cn109868251a通過(guò)使用一種具有一氧化氮合酶的肉葡萄球菌，其通過(guò)代謝產(chǎn)生的一氧化氮將肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為亞硝基肌紅蛋白，從而顯著改善肉制品的色澤。

3、cn110800913a公開(kāi)了一種替代加工肉制品中亞硝酸鹽的發(fā)色劑，其中一種發(fā)色劑為凝固酶陰性葡萄球菌的菌粉劑或菌懸液，在肉制品加工中的接種量為106～107cfu/g肉；另一種發(fā)色劑由上述菌粉劑或菌懸液和l-精氨酸組成，l-精氨酸添加量為肉制品質(zhì)量的0.6％～1.2％。所述菌粉劑或菌懸液通過(guò)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)制得。具有一氧化氮合酶的凝固酶陰性葡萄球菌可在肉制品加工中代謝產(chǎn)生一氧化氮，從而形成紅色的亞硝基肌紅蛋白，使加工肉制品呈現(xiàn)紅色澤；添加l-精氨酸，可以進(jìn)一步提升發(fā)色效果。

4、雖然上述微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生一氧化氮與肌紅蛋白結(jié)合生成亞硝基肌紅蛋白，但微生物產(chǎn)一氧化氮能力不足，導(dǎo)致肉制品中亞硝基肌紅蛋白含量遠(yuǎn)低于添加亞硝酸鹽的肉制品，肉品發(fā)色效果遠(yuǎn)弱于添加亞硝酸鹽的發(fā)色效果。而鋅原卟啉則是一種比亞硝基肌紅蛋白更具光熱穩(wěn)定性的色素。鋅原卟啉(zinc?protoporphyrin,znpp)是一種天然金屬卟啉色素，其結(jié)構(gòu)與血紅素相似，但卟啉環(huán)中心為zn2+，在光、熱及低氧環(huán)境中均表現(xiàn)出更優(yōu)異的穩(wěn)定性。znpp的形成主要通過(guò)兩種途徑：一是zn2+直接插入原卟啉(ppix)生成znpp；二是由亞鐵螯合酶(ferrochelatase,fech)催化，先將血紅素中的fe2+移除，隨后插入zn2+。fech廣泛存在于自然界中，包括植物、動(dòng)物和微生物等多種生物體內(nèi)。

5、目前，關(guān)于微生物生成znpp的研究主要集中無(wú)亞硝酸鹽腌制火腿加工過(guò)程中znpp的生成規(guī)律以及產(chǎn)生znpp菌株的篩選上，對(duì)微生物中fech的研究較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種腸膜明串珠菌及其重組表達(dá)亞鐵螯合酶的方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明研究團(tuán)隊(duì)首次在過(guò)期巴氏殺菌火腿中檢測(cè)到了大量znpp，并系統(tǒng)探究了影響znpp生成的關(guān)鍵因素，初步確定微生物是znpp生成的重要驅(qū)動(dòng)因素?；诖?，本發(fā)明篩選得到了具有發(fā)色能力的腸膜明串珠菌lms.hfut，并通過(guò)體外重組表達(dá)fech，對(duì)其分離純化以提高產(chǎn)量，最終將其添加到肉制品中，可以達(dá)到替代亞硝酸鹽的護(hù)色作用，提高肉品安全性。

3、具體而言，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

4、腸膜明串珠菌(leuconostoc?mesenteroides)lms.hfut，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2023年2月24日，生物保藏編號(hào)為cctcc?no：m2023193。

5、采用上述腸膜明串珠菌重組表達(dá)fech的方法，包括以下步驟：

6、(1)dna提?。簩⒛c膜明串珠菌lms.hfut菌株在mrs液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第三代并以1.0％v/v的接種量接種至液體培養(yǎng)基，然后以150～200rpm速度在37℃培養(yǎng)12～16h；隨后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，所述引物序列如seq?id?no:1-10所示；pcr反應(yīng)體系：taqpcrmaster?mix?25μl，2μl?dna，1μl正向和反向引物，21μl滅菌雙蒸水；梯度pcr反應(yīng)條件為：95℃下初始變性20min；34個(gè)循環(huán)：95℃30s，56℃30s，72℃60s；最后在72℃延伸5min；擴(kuò)增后，使用2％瓊脂糖凝膠電泳觀察pcr產(chǎn)物及其大小。

7、(2)制備感受態(tài)細(xì)胞：挑取bl21單菌落接種于lb液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床中培養(yǎng)12～16h；將培養(yǎng)后的菌液按照1％v/v接種于lb液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃搖床中培養(yǎng)至od600為0.4；將菌液在超凈臺(tái)中分裝至離心管中，在冰上靜置20min；冰浴結(jié)束后，以4℃，4000g離心5min，去除上清；向沉淀中加入100μl預(yù)冷的0.1m?cacl2溶液，輕輕吹打重懸液體，再次冰浴20min，隨后再次以4℃，4000g離心5min，棄去上清；向沉淀中再次加入100μl預(yù)冷的0.1m?cacl2溶液，輕輕吹打重懸液體，感受態(tài)細(xì)胞制備完成；保存在-80℃冰箱備用。

8、(3)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化：取出制備好的bl21感受態(tài)細(xì)胞于冰上，加入目的基因與pqe-80l載體連接的產(chǎn)物pqe-80l-fech，冰盒中靜置30min；隨后將其置于42℃水浴熱激90s，再立即取出于冰上冷卻3min，接著加入900μl?37℃預(yù)熱的無(wú)抗性lb液體培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，放入37℃恒溫?fù)u床中復(fù)蘇30min；復(fù)蘇后，吸取100μl菌液加至含100μg/ml?amp的lb固體平板中，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～18h。

9、(4)重組fech的誘導(dǎo)表達(dá)：從含有重組菌至lb液體培養(yǎng)基中，于37℃、170～220rpm條件下培養(yǎng)8～10h，得到種子液；將1％v/v的種子液接種至lb培養(yǎng)基中，在37℃、170～220rpm條件下培養(yǎng)；當(dāng)菌體濃度od600達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為0.5mm?iptg進(jìn)行誘導(dǎo)；繼續(xù)在37℃、150～200rpm條件下發(fā)酵12～16h，收集發(fā)酵液，離心，上清液即為胞外重組fech粗酶液。

10、(5)重組fech的收集和純化：誘導(dǎo)結(jié)束后，將發(fā)酵液在10000g、4℃條件下離心10～15min，收集菌體沉淀；隨后使用tris-hcl緩沖液重懸菌體，再次離心，重復(fù)此操作兩次以洗滌菌體；然后對(duì)洗滌后的菌體重懸液進(jìn)行冰浴超聲破碎，參數(shù)設(shè)置為：功率200～300w，工作時(shí)間2～4s，間隔時(shí)間3～5s，工作時(shí)間10～15min，循環(huán)2～3次；

11、在超聲破碎至菌液變得澄清后，4℃條件下12000g離心10～15min，收集上清液，即粗酶液；采用鎳親和層析法對(duì)獲得的粗酶液進(jìn)行純化；清洗和平衡含鎳填料的重力鎳柱后，用粗酶液流穿三次，隨后使用tris-hcl緩沖液對(duì)負(fù)載fech的鎳柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。

12、(6)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析重組酶的純度和分子量：將粗酶液及純化酶與蛋白上樣緩沖液混合均勻，隨后在沸水浴中加熱2～5min后進(jìn)行上樣；制備濃縮膠和分離膠，設(shè)置電泳電壓為70～100v；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1h，然后在脫色液中震蕩脫色，直至凝膠背景藍(lán)色褪去，最后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，記錄電泳結(jié)果。

13、本發(fā)明上述腸膜明串珠菌重組表達(dá)fech的方法制得的fech可以用于制備肉品發(fā)色劑，將其應(yīng)用于發(fā)酵香腸中，可以替代亞硝酸鹽的發(fā)色作用。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

15、本發(fā)明研究團(tuán)隊(duì)篩選出了產(chǎn)znpp的優(yōu)勢(shì)菌株——腸膜明串珠菌lms.hfut，并揭示了其發(fā)色機(jī)制?；诖耍景l(fā)明通過(guò)體外重組表達(dá)fech，并對(duì)其分離純化以提高產(chǎn)量，最終將其應(yīng)用于發(fā)酵香腸中，以替代亞硝酸鹽的發(fā)色作用，來(lái)控制香腸發(fā)酵過(guò)程的品質(zhì)并提高安全性。

16、生物保藏信息

17、腸膜明串珠菌lms.hfut，分類(lèi)命名為leuconostoc?mesenteroides，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱(chēng)：cctcc，保藏地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)校內(nèi)，保藏日期為2023年2月24日，生物保藏編號(hào)為cctcc?no：m2023193。