發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及干細胞領(lǐng)域及其在多維生物材料生產(chǎn)中的用途。特別地，本發(fā)明涉及包含脂肪干細胞(asc)的生物材料、制備和使用這種生物材料用于治療的方法。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、組織工程涉及通過使用活細胞來恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)或功能。一般過程包括細胞分離和增殖，然后是其中使用了支架材料的再植入程序。間充質(zhì)干細胞提供了成熟組織細胞的良好替代品，并具有許多優(yōu)勢，例如可作為骨和軟骨組織再生的細胞來源。

2、根據(jù)定義，干細胞的特征在于其能夠進行自我更新并且能夠進行多向分化并形成終末分化細胞。理想情況下，用于再生醫(yī)學應(yīng)用的干細胞應(yīng)符合以下標準：(i)應(yīng)大量存在(數(shù)百萬個至數(shù)十億個細胞)；(ii)可以通過微創(chuàng)程序收集和收獲；(iii)可沿著多個細胞譜系途徑以可再生的方式進行分化；(iv)可以安全有效地移植到自體宿主或同種異體宿主中。

3、研究表明，干細胞具有分化為中胚層、內(nèi)胚層和外胚層來源的細胞的能力。msc的可塑性通常是指保留在干細胞內(nèi)的跨越譜系屏障并采用其他組織所特有的細胞的表型、生化和功能特性的固有能力。例如，可以從骨髓和脂肪組織中分離成體間充質(zhì)干細胞。

4、脂肪干細胞具有多種功能，并具有深度再生能力。以下術(shù)語已用于標識相同的脂肪組織細胞群：脂肪干/基質(zhì)細胞(asc)；脂肪成體干細胞(adas)、脂肪成體基質(zhì)細胞、脂肪來源的基質(zhì)細胞(adsc)、脂肪基質(zhì)細胞(asc)、脂肪間充質(zhì)干細胞(admsc)、成脂肪細胞、周細胞、前脂肪細胞、脂肪組織提取細胞(pla)。使用這種多樣化的命名法已導致文獻上的重大混亂。為了解決這個問題，國際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會達成共識，采用術(shù)語“脂肪干細胞”(asc)來標識分離的、塑性黏附的多能細胞群。

5、組織重建包括骨和軟骨重建，還包括真皮、表皮和肌肉重建。當前，每種組織缺損都應(yīng)采用特定的治療方法來治療，每種方法都需要不同的發(fā)展。

6、因此，在本領(lǐng)域中仍然需要用于組織重建和/或再生的組織工程材料，該材料是完全生物相容的并且為指定的應(yīng)用提供適當?shù)臋C械特征，盡管可用于廣泛的組織。因此，本發(fā)明涉及由分化成多維結(jié)構(gòu)的asc與明膠制成的移植物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及具有多維結(jié)構(gòu)的生物材料，該生物材料包括分化的脂肪干細胞(asc)、細胞外基質(zhì)和明膠。

2、在一個實施方案中，明膠是豬明膠。在一個實施方案中，明膠為顆粒形式。在一個實施方案中，明膠的平均直徑為約50μm至約1000μm，優(yōu)選約75μm至約750μm，更優(yōu)選約100μm至約500μm。

3、在一個實施方案中，生物材料是三維的。

4、在某些實施方案中，生物材料是可模塑的或可成形的。

5、在一個實施方案中，將asc分化為選自成骨細胞、軟骨細胞、角質(zhì)細胞、成肌纖維細胞、內(nèi)皮細胞和脂肪細胞的細胞。

6、本發(fā)明還涉及包含如上所述的多維生物材料的醫(yī)療裝置或藥物組合物。

7、本發(fā)明的另一個方面是一種用于生產(chǎn)如上所述的多維生物材料的方法，其包括以下步驟：

8、-使脂肪干細胞(asc)增殖，

9、-使第四代asc發(fā)生分化，和

10、-進行多維誘導，優(yōu)選3d誘導。

11、本發(fā)明還涉及可通過如上所述的方法獲得的多維生物材料。

12、本發(fā)明的另一個目的是如上所述的生物材料，其用于治療組織缺損。在一個實施方案中，所述組織選自骨、軟骨、真皮、表皮、肌肉、內(nèi)皮和脂肪組織。

13、定義

14、在本發(fā)明中，以下術(shù)語具有以下含義：

15、-值之前的術(shù)語“約”表示為該值的正負10％。

16、-術(shù)語“脂肪組織”是指任意脂肪組織。脂肪組織可以是褐色或白色脂肪組織，其源自皮下、網(wǎng)膜/內(nèi)臟、乳腺、性腺或其他脂肪組織位點。優(yōu)選地，脂肪組織是皮下白色脂肪組織。這樣的細胞可以包含原代細胞培養(yǎng)物或永生化細胞系。脂肪組織可以來自具有脂肪組織的任何活的或死的生物。優(yōu)選地，脂肪組織是動物的，更優(yōu)選地是哺乳動物的，最優(yōu)選地，脂肪組織是人的。脂肪組織的方便來源是吸脂手術(shù)，但是，脂肪組織的來源或分離脂肪組織的方法對本發(fā)明不重要。

17、-如本文所用，術(shù)語“脂肪干細胞”是指脂肪組織的“非脂肪細胞”部分。細胞可以是新鮮的，也可以是培養(yǎng)中的?！爸靖杉毎?asc)是指源自脂肪組織的基質(zhì)細胞，其可以用作多種不同細胞類型的前體，例如但不限于脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞的前體。

18、-術(shù)語“再生”或“組織再生”包括但不限于由本公開的asc生長、產(chǎn)生或重建新細胞類型或組織。在一個實施方案中，這些細胞類型或組織包括但不限于骨原細胞(例如成骨細胞)、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經(jīng)元細胞和肌管。在特定的實施方案中，術(shù)語“再生”或“組織再生”是指由本公開的asc產(chǎn)生或重建骨原細胞(例如成骨細胞)。

19、-如本文所用，術(shù)語“生長因子”是促進組織生長、細胞增殖、血管形成等的分子。在特定的實施方案中，術(shù)語“生長因子”包括促進骨組織的分子。

20、-如本文所用，術(shù)語“培養(yǎng)的”是指在體外、體內(nèi)或離體環(huán)境中經(jīng)歷細胞分裂或未經(jīng)歷細胞分裂的一種或多于一種細胞。體外環(huán)境可以是本領(lǐng)域已知的適合于體外維持細胞的任何培養(yǎng)基，例如合適的液體培養(yǎng)基或瓊脂。適用于細胞培養(yǎng)的體外環(huán)境的具體實例描述于culture?of?animal?cells：a?manual?of?basic?techniques(3rd?edition)，1994，r.i.freshney(ed.)，wiley-liss，inc.；cells：a?laboratory?manual(vol.1)，1998，d.l.spector，r.d.goldman，l.a.leinwand(eds.)，cold?spring?harbor?laboratorypress；和animal?cells：culture?and?media，1994，d.c.darling，s.j.morgan?john?wileyand?sons，ltd.中。

21、-術(shù)語“匯合度”是指細胞培養(yǎng)表面(例如培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶)中貼壁細胞的數(shù)量，即，被細胞覆蓋的表面的比例。匯合度為100％表示表面完全被細胞覆蓋。在一個實施方案中，表述“細胞達到匯合”或“細胞是匯合的”是指細胞覆蓋表面的80％至100％。在一個實施方案中，表述“細胞亞匯合”是指細胞覆蓋了表面的60％至80％。在一個實施方案中，表述“細胞過度匯合”是指細胞覆蓋至少100％的表面和/或100％匯合度下持續(xù)數(shù)小時或數(shù)天。

22、-術(shù)語“冷藏”是指以低于對象正常生理溫度的溫度進行的治療。例如，在約-196℃至約+32℃選擇一個或多于一個溫度，持續(xù)延長的時間段，例如至少約一個小時、至少約一天、至少約一周、至少約4周、至少約6個月等。在一個實施方案中，“冷藏”是指在低于0℃的溫度下進行處理。冷藏可以手動進行，或者優(yōu)選地使用能夠執(zhí)行冷藏程序的專門設(shè)備來進行。在一個實施方案中，術(shù)語“冷藏”包括本領(lǐng)域中稱為“冷凍”和“深低溫保藏”的方法。技術(shù)人員將理解，冷藏方法可包括其他步驟，包括為此目的添加試劑。

23、-如本文所用，術(shù)語“非胚胎細胞”是指未從胚胎分離的細胞。非胚胎細胞可以分化或不分化。非胚胎細胞可以指幾乎任何體細胞，例如從動物子宮外分離的細胞。這些實例并不意味著是限制性的。

24、-如本文所用，術(shù)語“分化的細胞”是指已從非特異性表型發(fā)展為特異性表型的前體細胞。例如，脂肪干細胞可以分化為骨原細胞。

25、-如本文所用，術(shù)語“分化培養(yǎng)基”是指在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中用于產(chǎn)生分化細胞的化合物的集合之一?；衔锏淖饔梅绞綗o限制。例如，該試劑可以通過誘導或協(xié)助表型的改變，促進具有特定表型的細胞的生長或阻止其他表型的生長來輔助分化過程。它也可以作為可能在培養(yǎng)基中的或由細胞群合成的其他因子的抑制劑，否則其他因子將導致分化為不期望的細胞類型的分化途徑。

26、-術(shù)語“處理”、“治療”或“緩解”是指其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)骨缺損的治療性治療。需要治療的患者包括已經(jīng)患有該疾病的患者以及易于患該疾病的患者或待預(yù)防骨缺損的患者。如果對象在接受根據(jù)本發(fā)明的方法的治療量的生物材料后，患者表現(xiàn)出以下一種或多于一種情況的可觀察到的和/或可測量的減少或缺失時，則成功地“治療”了對象的骨缺損：減少了骨缺損和/或在某種程度上緩解了與骨缺損有關(guān)的一種或多于一種癥狀；降低發(fā)病率和死亡率，并改善生活質(zhì)量問題?？梢酝ㄟ^醫(yī)師熟悉的常規(guī)程序容易地測量用于評估疾病的成功治療和改善的上述參數(shù)。

27、在所公開的生物材料的治療用途中，“同種異體”療法中，供體和受體是同一物種的不同個體，而“自體”療法中，供體和受體是同一個體，并且在“異種”療法中，供體來源于與受體不同物種的動物。

28、-術(shù)語“有效量”是指足以產(chǎn)生有益或期望結(jié)果，包括臨床結(jié)果的量。有效量可以施用一次或多于一次。

29、-術(shù)語“對象”是指哺乳動物，優(yōu)選人。對象的實例包括人、非人靈長類、狗、貓、小鼠、大鼠、馬、牛及其轉(zhuǎn)基因物種。在一個實施方案中，對象可以是“患者”，即溫血動物，更優(yōu)選為人，他/她/它在等待接收或正在接受醫(yī)療護理，或曾經(jīng)/正在/將要成為醫(yī)療手術(shù)的目標，或被監(jiān)測疾病的發(fā)展。在一個實施方案中，對象是成年人(例如18歲以上的人類對象)。在另一個實施方案中，對象是兒童(例如18歲以下的人類對象)。在一個實施方案中，對象是男性/雄性。在另一個實施方案中，所述對象是女性/雌性。

30、-術(shù)語“生物相容的”是指與諸如細胞、細胞培養(yǎng)物、組織或生物體的生物系統(tǒng)相容的無毒材料。