本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領(lǐng)域，特別是涉及一種表達(dá)hpv?18型主要衣殼蛋白l1的多核苷酸及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、宮頸癌是女性較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，其具有較高的發(fā)病率及死亡率，誘發(fā)宮頸癌的常見(jiàn)的因素為人乳頭狀瘤病毒(hpv)，其臨床癥狀以陰道出血最為常見(jiàn)。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期，早期宮頸癌為0～ⅲa期，早期宮頸癌的癥狀多局限于宮頸，在沒(méi)有蔓延至其他周?chē)M織時(shí)，往往沒(méi)有癥狀表現(xiàn)。對(duì)于早期宮頸癌患者，臨床治療以保證患者的卵巢及陰道功能為重點(diǎn)，因此，阻斷hpv感染是預(yù)防宮頸癌的重要途徑之一。

2、世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署在其hpv疫苗立場(chǎng)文件中，將12種與人類(lèi)癌癥明確相關(guān)的hpv亞型(即hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58和hpv59)定義為高危型人乳頭瘤病毒(hr-hpv)。hpv16和hpv18是最常見(jiàn)的2類(lèi)hr-hpv。為了有效預(yù)防這種病毒的感染，研發(fā)基于l1蛋白的疫苗成為了重要的研究方向。l1蛋白是hpv病毒的主要衣殼蛋白，能夠自組裝形成與天然病毒相似的vlps。這些vlps不僅能夠激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，還能夠誘導(dǎo)生成針對(duì)hpv的中和抗體，從而提供有效的免疫保護(hù)。鑒于此，生產(chǎn)出產(chǎn)量更高，對(duì)中和抗體親和能力更強(qiáng)，且產(chǎn)品性質(zhì)更加均一的人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1仍迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種表達(dá)量高、產(chǎn)品性質(zhì)更加均一，且中和抗體的親和能力較強(qiáng)的編碼人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1基因及其表達(dá)載體、重組菌株和應(yīng)用。

2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一方面，本發(fā)明提供一種人工設(shè)計(jì)合成的多核苷酸，其編碼人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1，所述多核苷酸序列為具有seq?id?no.1所示的多核苷酸序列至少90％以上同一性的序列，優(yōu)選為92％。

4、優(yōu)選地，所述多核苷酸序列為在seq?id?no.1所示的多核苷酸序列基礎(chǔ)上對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化為以下方式中的一種或多種：天冬氨酸由gac優(yōu)化為gat；脯氨酸由cct優(yōu)化為cca；絲氨酸由tcc優(yōu)化為tct；苯丙氨酸由ttc優(yōu)化為ttt；組氨酸由cac優(yōu)化為cat；天冬酰胺由aac優(yōu)化為aat；谷氨酸由gag優(yōu)化為gaa；異亮氨酸由atc優(yōu)化為att。

5、優(yōu)選地，所述多核苷酸序列如seq?id?no.2所示或其互補(bǔ)序列。

6、優(yōu)選地，所述多核苷酸序列為在seq?id?no.2所示的多核苷酸序列的5’和/或3’端分別且獨(dú)立地添加bstb?i酶切位點(diǎn)、kpn?i酶切位點(diǎn)以及kozak序列中的一個(gè)或多個(gè)。

7、優(yōu)選為，所述多核苷酸序列如seq?id?no.3所示或其互補(bǔ)序列。

8、一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括上述任一項(xiàng)所述的多核苷酸。

9、優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自pgex-6p-1、pgex-4t-2、pmal、ppicz、ppic6、pgapz、pao815和pet28a中的一種或多種。

10、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自ppicz、ppic6、pgapz、pao815中的一種或多種。

11、更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自ppiczαb。

12、一方面，本發(fā)明提供一種重組菌株，所述重組菌株包括上述所述的表達(dá)載體，或其基因組中整合有上述任一項(xiàng)所述的多核苷酸。

13、優(yōu)選地，所述重組菌株為畢赤酵母菌株。

14、優(yōu)選地，所述重組菌株的構(gòu)建方法包括以下步驟：

15、(1)設(shè)計(jì)并合成上述任一項(xiàng)所述的多核苷酸；

16、(2)構(gòu)建含有步驟(1)獲得的多核苷酸序列的畢赤酵母表達(dá)載體；

17、(3)將步驟(2)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，得到所述表達(dá)人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1的菌株。

18、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述培養(yǎng)在含有抗生素的ypds培養(yǎng)基和/或ypd培養(yǎng)基中進(jìn)行。

19、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)具體步驟為：將所述轉(zhuǎn)化體涂布在含有80～120μg/ml抗生素的ypds培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，將所述轉(zhuǎn)化體接種至含有80～120μg/ml抗生素的ypd液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇陽(yáng)性菌液接種至含有200～400μg/ml抗生素的ypd液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇陽(yáng)性菌液接種至含有500～700μg/ml抗生素的ypd液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇陽(yáng)性菌液接種至含有800～1500μg/ml抗生素的ypd液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇陽(yáng)性菌液接種至含有2500～3500μg/ml抗生素的ypd液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取陽(yáng)性菌液涂布在含有800～1500μg/ml抗生素的ypds培養(yǎng)基平板培養(yǎng)分離得到所述表達(dá)人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1的菌株。

20、優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自pgex-6p-1、pgex-4t-2、pmal、ppicz、ppic6、pgapz、pao815和pet28a中的一種或多種。

21、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自ppicz、ppic6、pgapz、pao815中的一種或多種。

22、更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自ppiczαb。

23、優(yōu)選地，所述抗生素為博來(lái)霉素。

24、一方面，本發(fā)明提供一種制備人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1的方法，所述方法包括培養(yǎng)如上述所述的重組菌株，以及任選從培養(yǎng)液中分離人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1。

25、優(yōu)選地，所述方法還包括純化人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1的步驟。

26、優(yōu)選地，所述純化人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1的步驟是依次采用poros50hs層析柱、cht?ii層析柱進(jìn)行純化。

27、一方面，本發(fā)明提供如上述任一項(xiàng)所述的多核苷酸，或上述所述的表達(dá)載體，或上述任一項(xiàng)所述的重組菌株在制備hpv疫苗中的用途。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的主要有益技術(shù)效果在于：

29、本發(fā)明對(duì)天然的hpv?18l1基因進(jìn)行改造，對(duì)其所有的氨基酸進(jìn)行畢赤酵母密碼子偏好性分析，并盡可能的采用使用頻率最高的密碼子，同時(shí)避免轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mrna的gc比例過(guò)高，以及避免常用的限制性酶切位點(diǎn)等信息設(shè)計(jì)出一個(gè)全新的hpv?18l1序列，其編碼hpv18l1蛋白產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于親本序列。而且，其編碼得到的hpv?18l1中和抗體的親和能力更強(qiáng)、均一性更好。

技術(shù)特征：

1.一種人工設(shè)計(jì)合成的多核苷酸，其編碼人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1，其特征在于，所述多核苷酸序列為具有seq?id?no.1所示的多核苷酸序列至少90％以上同一性的序列，優(yōu)選為92％。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列為在seq?id?no.1所示的多核苷酸序列基礎(chǔ)上對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化為以下方式中的一種或多種：天冬氨酸由gac優(yōu)化為gat；脯氨酸由cct優(yōu)化為cca；絲氨酸由tcc優(yōu)化為tct；苯丙氨酸由ttc優(yōu)化為ttt；組氨酸由cac優(yōu)化為cat；天冬酰胺由aac優(yōu)化為aat；谷氨酸由gag優(yōu)化為gaa；異亮氨酸由atc優(yōu)化為att。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列如seq?id?no.2所示或其互補(bǔ)序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列為在seq?id?no.2所示的多核苷酸序列的5’和/或3’端分別且獨(dú)立地添加bstb?i酶切位點(diǎn)、kpn?i酶切位點(diǎn)以及kozak序列中的一個(gè)或多個(gè)，

5.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包括權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的多核苷酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體選自pgex-6p-1、pgex-4t-2、pmal、ppicz、ppic6、pgapz、pao815和pet28a中的一種或多種；優(yōu)選為ppicz、ppic6、pgapz、pao815中的一種或多種，更優(yōu)選為ppiczαb。

7.一種重組菌株，其特征在于，所述重組菌株包括權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體，或其基因組中整合有權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的多核苷酸；

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組菌株，其特征在于，步驟(3)中，所述培養(yǎng)在含有抗生素的ypds培養(yǎng)基和/或ypd培養(yǎng)基中進(jìn)行；

9.一種制備人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1的方法，其特征在于，所述方法包括培養(yǎng)如權(quán)利要求7或8所述的重組菌株，以及任選從培養(yǎng)液中分離人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白l1；

10.如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的多核苷酸，或權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體，或權(quán)利要求7～8任一項(xiàng)所述的重組菌株在制備hpv疫苗中的用途。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種表達(dá)HPV?18型主要衣殼蛋白L1的多核苷酸及其應(yīng)用，具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種優(yōu)化的編碼人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白L1的編碼基因，所述基因?yàn)榫哂蠸EQ?ID?NO.1所示的多核苷酸序列至少90％以上同一性的序列，所述基因在轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞后可高效的表達(dá)重組人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白L1。

技術(shù)研發(fā)人員：黃玲玲,林曉楓,李淑瑞,郭雄亮,邰忠毅,吳宗圣,張建城,曹玉鋒,史力
受保護(hù)的技術(shù)使用者：怡道生物科技（蘇州）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15