本發(fā)明涉及基因工程，更具體的說是涉及一種參與三萜皂苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因篩選鑒定及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、三萜皂苷是中藥斷血流(主要含柴胡皂苷及醉魚草皂苷)和柴胡(以柴胡皂苷為核心活性成分)的關(guān)鍵藥效物質(zhì)。三萜皂苷在天然藥材中的含量較低，面臨化學(xué)提取成本高、純化過程污染嚴(yán)重等問題，在一定程度上限制了其新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用。因此，三萜皂苷的生物合成成為研究熱點(diǎn)。

2、三萜皂苷是一類天然化合物，其基本結(jié)構(gòu)包括：三萜骨架和糖鏈，其中糖鏈部分是通過糖苷鍵連接到三萜骨架上，糖鏈的種類、數(shù)量和連接位置決定了三萜皂苷的多樣性和功能。三萜皂苷的糖基化修飾(尤其是c-3位)直接決定其結(jié)構(gòu)多樣性與藥理活性，例如抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用。目前研究表明，尿苷二磷酸依賴的糖基轉(zhuǎn)移酶(ugts)是催化三萜皂苷糖基化修飾的核心酶類，負(fù)責(zé)將活化的糖供體，如udp-巖藻糖、udp-葡萄糖、udp-鼠李糖等轉(zhuǎn)移到三萜骨架上，形成糖苷鍵。不同的糖基轉(zhuǎn)移酶可以識別不同的糖供體和受體，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣的三萜皂苷。因此，糖基轉(zhuǎn)移酶對三萜皂苷的合成至關(guān)重要。

3、然而，目前針對三萜皂苷c-3位糖基化修飾的關(guān)鍵ugt酶及其編碼基因仍未被明確鑒定，導(dǎo)致其生物合成途徑解析受阻，且無法通過合成生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，亟需開展系統(tǒng)性研究。

4、因此，如何提供一種可以催化三萜類化合物c-3位糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種參與三萜皂苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因篩選鑒定及應(yīng)用，成功的發(fā)現(xiàn)了可以催化c-3位葡萄糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶，為三萜皂苷類成分合成生物學(xué)研究提供基因元器件，解決了稀有皂苷的生物資源問題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種參與三萜皂苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是由seq?id?no.6所示氨基酸序列或seq?id?no.6所示氨基酸序列經(jīng)過替換、缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后仍具有相同酶催化性能的氨基酸序列組成。

4、本發(fā)明的再一目的在于提供：一種編碼上述糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，所述基因是由seqid?no.3所示核苷酸序列或seq?id?no.3所示核苷酸序列經(jīng)過替換、缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)堿基后仍具有相同酶催化性能的核苷酸序列組成。

5、本發(fā)明的再一目的在于提供：一種擴(kuò)增上述糖基轉(zhuǎn)移酶基因的引物組，所述引物組包括ccugt-g57755-f和ccugt-g57755-r，具體序列如下：

6、ccugt-g57755-f：5’-atggagatggagatggagaattacgaact-3’，seq?id?no.1；

7、ccugt-g57755-r：5’-ttaagcattattaatgttactaataacatcc?tc-3’，seq?id?no.2。

8、本發(fā)明的再一目的在于提供：一種含有上述糖基轉(zhuǎn)移酶基因的生物材料，所述生物材料為重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

9、本發(fā)明的再一目的在于提供上述糖基轉(zhuǎn)移酶或上述編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因或上述生物材料的應(yīng)用，所述應(yīng)用為以下任一方向：

10、(1)在制備糖基轉(zhuǎn)移酶和/或含有糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用；

11、(2)在制備糖基轉(zhuǎn)移酶突變體和/或含有糖基轉(zhuǎn)移酶突變體相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用；

12、(3)在制備重組糖基轉(zhuǎn)移酶和/或含有重組糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用；

13、(4)在三萜皂苷c-3位葡萄糖基化修飾中的應(yīng)用；

14、(5)在三萜皂苷糖基化修飾中的應(yīng)用；

15、(6)在三萜皂苷生物合成中的應(yīng)用。

16、優(yōu)選的，在步驟(4)-(6)的應(yīng)用中糖基轉(zhuǎn)移酶利用糖基供體udp-葡萄糖催化prosaikogenina生成saikosaponinb1、saikosaponin?c1及saikosaponin?x。

17、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

18、本發(fā)明利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測風(fēng)輪菜根、莖、葉中8種目標(biāo)成分的含量差異。然后基于風(fēng)輪菜基因組，鑒定風(fēng)輪菜糖基轉(zhuǎn)移酶gt基因家族成員，構(gòu)建進(jìn)化樹分析風(fēng)輪菜與其他物種gt之間的進(jìn)化關(guān)系，初篩參與三萜皂苷糖基化修飾的關(guān)鍵酶。最后基于風(fēng)輪菜不同組織部位轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析差異基因表達(dá)，進(jìn)一步篩選參與三萜皂苷糖基化修飾的關(guān)鍵酶基因。采用上述方法成功篩選到糖基轉(zhuǎn)移酶基因。

19、利用上述基因構(gòu)建得到pet28a-mbp-ccugt-g57755原核表達(dá)載體，成功獲取了糖基轉(zhuǎn)移酶，以prosaikogenin?a為底物，進(jìn)行了體外酶的催化功能驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明糖基轉(zhuǎn)移酶能利用糖基供體udp-葡萄糖催化prosaikogenina生成saikosaponinb1、saikosaponin?c1及saikosaponin?x。綜上，本發(fā)明糖基轉(zhuǎn)移酶催化三萜類化合物c-3位葡萄糖基化修飾，為三萜皂苷類成分合成生物學(xué)研究提供基因元器件，解決了稀有皂苷的生物資源問題。

技術(shù)特征：

1.一種參與三萜皂苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是由seqid?no.6所示氨基酸序列或seq?id?no.6所示氨基酸序列經(jīng)過替換、缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸后仍具有相同酶催化性能的氨基酸序列組成。

2.一種編碼權(quán)利要求1所述糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，其特征在于，所述基因是由seq?idno.3所示核苷酸序列或seq?id?no.3所示核苷酸序列經(jīng)過替換、缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)堿基后仍具有相同酶催化性能的核苷酸序列組成。

3.一種擴(kuò)增權(quán)利要求2所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因的引物組，其特征在于，所述引物組包括ccugt-g57755-f和ccugt-g57755-r，具體序列如下：

4.一種含有權(quán)利要求2所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料為重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

5.權(quán)利要求1所述糖基轉(zhuǎn)移酶或權(quán)利要求2所述編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因或權(quán)利要求4所述生物材料的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為以下任一方向：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(4)-(6)的應(yīng)用中糖基轉(zhuǎn)移酶利用糖基供體udp-葡萄糖催化prosaikogenina生成saikosaponin?b1、saikosaponin?c1和saikosaponin?x。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種參與三萜皂苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因篩選鑒定及應(yīng)用。屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于中藥斷血流基原植物—風(fēng)輪菜多組學(xué)研究篩選獲得糖基轉(zhuǎn)移酶基因，構(gòu)建得到pET28a?MBP?CcUGT?g57755原核表達(dá)載體，成功獲取了糖基轉(zhuǎn)移酶，研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明糖基轉(zhuǎn)移酶能利用糖基供體UDP?葡萄糖催化Prosaikogenin?A生成Saikosaponin?B1、Saikosaponin?c1及Saikosaponin?X，揭示了糖基轉(zhuǎn)移酶催化功能，為三萜皂苷類成分合成生物學(xué)研究提供基因元器件，解決了稀有皂苷的生物資源問題。

技術(shù)研發(fā)人員：浦香東,胡雯妍,胡艷,周澤,王麗琴,黃子怡,李余芳,郭世文,陳娜,汪旭
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/22