本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，特別是涉及一種基于微滴式數(shù)字pcr的dna降解程度的檢測(cè)引物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、dna分型的成功通常取決于dna的數(shù)量和質(zhì)量。在法醫(yī)案件中，dna樣本可能因環(huán)境因素或自然污染物而高度降解導(dǎo)致傳統(tǒng)檢測(cè)方法失效，這是當(dāng)今法醫(yī)案件面臨的主要挑戰(zhàn)之一。目前基于毛細(xì)管電泳(ce)檢測(cè)技術(shù)的短串聯(lián)重復(fù)(str)分型是法醫(yī)遺傳學(xué)中最強(qiáng)大的工具之一，但dna降解會(huì)降低遺傳標(biāo)記的擴(kuò)增效率，甚至導(dǎo)致電泳失敗，尤其是str分型里片段較大的等位基因。這些降解樣本可能會(huì)在法庭上提供關(guān)鍵信息，因此利用這些樣本的能力變得非常重要。同時(shí)，在許多情況下，法醫(yī)樣本中人類dna的數(shù)量和質(zhì)量是可以預(yù)測(cè)的，例如在實(shí)際案件中，從毛干、骸骨、福爾馬林固定的組織和舊案樣本中提取的dna都會(huì)降低最終目標(biāo)dna的數(shù)量和質(zhì)量。在法醫(yī)案件中，dna數(shù)量和質(zhì)量的測(cè)定有助于法醫(yī)工作者選擇更合適的檢測(cè)方法。靈敏而準(zhǔn)確的dna降解評(píng)估可以為法醫(yī)證據(jù)的解釋提供支持，并幫助解釋str圖譜的低質(zhì)量是由于str分析過程出現(xiàn)的問題還是dna提取過程出現(xiàn)的問題，或是其他原因。此外，在str擴(kuò)增之前對(duì)dna的數(shù)量和質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估可提高首次成功率，因此這一步驟已成為法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室dna分析工作流程中的關(guān)鍵步驟。

2、目前，通常使用實(shí)時(shí)定量pcr(qpcr)和瓊脂糖凝膠電泳來評(píng)估dna降解程度。瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)是可以直觀地確定降解片段的長度和分布，但它并不精確，而且需要較高的dna濃度。因此，法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室目前使用qpcr試劑盒來評(píng)估dna降解情況。大多數(shù)市售的法醫(yī)人類dna定量試劑盒通過檢測(cè)大、小兩種不同長度擴(kuò)增片段的濃度來評(píng)估降解程度，并計(jì)算降解指數(shù)(di)，即小片段濃度/大片段濃度。此方法對(duì)降解程度的評(píng)估較粗略，不能很好的幫助選擇其他的檢測(cè)技術(shù)。并且，qpcr更容易受到pcr抑制劑的影響，尤其在復(fù)雜樣本中，dna提取過程中共同提取的pcr抑制劑可能會(huì)嚴(yán)重阻礙pcr擴(kuò)增。此外，qpcr的“絕對(duì)定量”依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，而標(biāo)準(zhǔn)曲線是由已知量的模板dna標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋后得出的。標(biāo)準(zhǔn)dna的可靠性和一致性極大地影響了qpcr對(duì)未知樣本定量的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，尤其是當(dāng)拷貝數(shù)已經(jīng)很低時(shí)，很難檢測(cè)到樣本間拷貝數(shù)的微小差異。

3、此外，上述檢測(cè)技術(shù)中的瓊脂糖電泳，無法檢測(cè)極不平衡的混合樣本。瓊脂糖凝膠電泳精確度不高，而且需要較高的dna濃度，并且不適用于降解dna的定量。而qpcr試劑盒評(píng)估dna降解程度容易受到pcr抑制劑的影響。qpcr的“絕對(duì)定量”依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果的重復(fù)性較差，尤其是當(dāng)拷貝數(shù)已經(jīng)很低時(shí)，很難檢測(cè)到樣本間拷貝數(shù)的微小差異。因此，亟需提供一種能夠準(zhǔn)確定量高度降解dna樣本降解程度，并有效輔助后續(xù)dna分型的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種基于微滴式數(shù)字pcr的dna降解程度的檢測(cè)引物組合及其應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。本發(fā)明利用數(shù)字pcr技術(shù)對(duì)大、中、小三種不同長度的靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，利用三種靶標(biāo)的數(shù)量，能夠準(zhǔn)確評(píng)估dna降解程度，幫助確定后續(xù)str分型方法，為法醫(yī)學(xué)高度降解檢材的評(píng)估及檢測(cè)提供了一種新的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、快速有效的技術(shù)手段。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一種dna降解程度的檢測(cè)引物組合，所述檢測(cè)引物組合包括檢測(cè)235bp靶標(biāo)的引物對(duì)及探針，檢測(cè)145bp靶標(biāo)的引物對(duì)及探針，檢測(cè)75bp靶標(biāo)的引物對(duì)及探針；

4、所述檢測(cè)235bp靶標(biāo)的引物對(duì)及探針的核苷酸序列分別如seq?id?no.1-3所示；

5、所述檢測(cè)145bp靶標(biāo)的引物對(duì)及探針的核苷酸序列分別如seq?id?no.4-6所示；

6、所述檢測(cè)75bp靶標(biāo)的引物對(duì)及探針的核苷酸序列分別如seq?id?no.7-9所示。

7、可選的，所述檢測(cè)235bp靶標(biāo)的探針帶有紫色cy5熒光標(biāo)記；所述檢測(cè)145bp靶標(biāo)的探針帶有藍(lán)色fam熒光標(biāo)記；所述檢測(cè)75bp靶標(biāo)的探針帶有綠色vic熒光標(biāo)記。

8、本發(fā)明還提供上述檢測(cè)引物組合在制備評(píng)估dna降解程度的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

9、可選的，所述產(chǎn)品包括試劑或試劑盒。

10、本發(fā)明還提供一種評(píng)估dna降解程度的微滴式數(shù)字pcr試劑盒，包含上述檢測(cè)引物組合。

11、可選的，所述微滴式數(shù)字pcr試劑盒中還包含復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液。

12、本發(fā)明還提供上述檢測(cè)引物組合或上述微滴式數(shù)字pcr試劑盒在評(píng)估dna降解程度中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明還提供一種評(píng)估dna降解程度的方法，包括如下步驟：

14、(1)提取待測(cè)樣本中的dna；

15、(2)以步驟(1)的dna為模板，利用上述微滴式數(shù)字pcr試劑盒進(jìn)行微滴式數(shù)字pcr，根據(jù)pcr檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算降解比率dr1和dr2，評(píng)估dna降解程度；

16、若dr1小于0.8且dr1大于0.02，表示dna輕中度降解；

17、若dr1小于0.02且dr2大于0.05，表示dna高度降解；

18、若dr2<0.05，表示dna極度降解。

19、所述微滴式數(shù)字pcr的反應(yīng)體系為：復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)混合液10.0μl，檢測(cè)235bp靶標(biāo)的引物混合物0.9μl，檢測(cè)145bp靶標(biāo)的引物混合物0.9μl，檢測(cè)75bp靶標(biāo)的引物混合物0.9μl，檢測(cè)235bp靶標(biāo)的探針0.5μl，檢測(cè)145bp靶標(biāo)的探針0.5μl，檢測(cè)75bp靶標(biāo)的探針0.5μl，模板dna?1.0μl，去離子水補(bǔ)至20μl；

20、所述微滴式數(shù)字pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，10分鐘；95℃，30秒，58℃，60秒，45個(gè)循環(huán)；然后98℃，10分鐘；16℃保存。

21、可選的，所述檢測(cè)235bp靶標(biāo)的引物混合物中正向引物和反向引物的濃度均為20μm/l；

22、所述檢測(cè)145bp靶標(biāo)的引物混合物中正向引物和反向引物的濃度均為20μm/l；

23、所述檢測(cè)75bp靶標(biāo)的引物混合物中正向引物和反向引物的濃度均為20μm/l；

24、所述檢測(cè)235bp靶標(biāo)的探針的濃度為100μm/l；

25、所述檢測(cè)145bp靶標(biāo)的探針的濃度為100μm/l；

26、所述檢測(cè)75bp靶標(biāo)的探針的濃度為100μm/l。

27、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

28、本發(fā)明根據(jù)3號(hào)染色體非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了大、中、小三種不同長度的靶標(biāo)，并設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)三種靶標(biāo)的特異性引物和探針，其特異性良好，并具有良好的再現(xiàn)性、結(jié)果穩(wěn)定可靠，可檢測(cè)出低至2個(gè)拷貝的高度降解dna。

29、根據(jù)三種不同長度靶標(biāo)的特異性引物及探針，本發(fā)明建立了通過dna數(shù)量和降解比率(dr)的組合來評(píng)估降解程度的方法：首先利用三種不同長度靶標(biāo)的特異性引物及探針檢測(cè)三種長度靶標(biāo)的數(shù)量，然后計(jì)算降解比率，根據(jù)降解比率確定dna降解程度，從而對(duì)其str分型檢測(cè)過程進(jìn)行優(yōu)化，提高dna輸入量或pcr循環(huán)次數(shù)，以便提高str的分型成功率。本發(fā)明將三種不同長度靶標(biāo)的數(shù)量、降解比率與獲得的str圖譜質(zhì)量聯(lián)系起來，可以更直觀地確定傳統(tǒng)str檢測(cè)試劑盒的分型成功率。因此，本發(fā)明可用于快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)和評(píng)估高度降解dna的降解程度，從而幫助法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室選擇str分型或其他降解dna檢測(cè)技術(shù)，并提供證據(jù)解釋，為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)τ诟叨冉到鈾z材的檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。