本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種用于食管癌診斷、治療和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、食管癌（esophageal?carcinoma，ec）是全球致死相關(guān)癌癥中居第六位的腫瘤。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal?squamous?cell?carcinoma，escc）又稱為食管鱗癌是食管癌中最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型，特別是在東亞，非洲東部和南部高發(fā)。盡管對(duì)于食管癌的診斷和治療方法有所改善，但由于早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，食管鱗癌晚期患者的生存率仍然很低，其患者5年生存率仍較低。根據(jù)病因?qū)W和流行病學(xué)研究表明，食管癌的發(fā)生是多種因素共同發(fā)揮效應(yīng)而導(dǎo)致的疾病。因此，當(dāng)下尋找導(dǎo)致食管癌的致病因素和發(fā)病機(jī)制尤為重要。

2、食管癌的發(fā)生是由環(huán)境和遺傳因素共同作用引起的。dna甲基化是人類基因組的主要表觀遺傳形式。在大多數(shù)類型的癌癥中，dna甲基化通常存在異常。甲基化是基因組dna中胞嘧啶的共價(jià)修飾，主要發(fā)生在脊椎動(dòng)物的cpg二核苷酸中，并且通常與長(zhǎng)期轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。現(xiàn)有技術(shù)已發(fā)現(xiàn)在食管癌中， p16和 rassf1a基因的啟動(dòng)子區(qū)域均存在高甲基化狀態(tài)，高甲基化抑制基因的表達(dá)，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中mir-203和mir-34a甲基化水平明顯高于癌旁正常組織，且它們的高甲基化和表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性，經(jīng)分析還發(fā)現(xiàn)其高甲基化水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明其高甲基化水平促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)展。還發(fā)現(xiàn)，plce1基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化調(diào)控其蛋白高表達(dá)，并通過(guò)nfκb通路和vegf-c/bcl-2的表達(dá)促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的血管生成和增殖。因此，探索食管癌中基因的甲基化對(duì)于escc的早期診斷，精確預(yù)后和個(gè)體化治療具有重要意義。

3、rh家族c糖蛋白（rh?type?c?glycoprotein,?rhcg）屬于rhesus?(rh)家族成員之一，最初被鑒定為人類紅細(xì)胞中的rh血型抗原。rh家族是跨膜蛋白，其特征是具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)內(nèi)n-末端及c-末端。根據(jù)功能可將rh家族蛋白分為兩大類：氨轉(zhuǎn)運(yùn)型rh糖蛋白（rhag、rhbg和rhcg）和非轉(zhuǎn)運(yùn)型rh蛋白（rhd和rhce）。rhbg和rhcg作為氨轉(zhuǎn)運(yùn)體，在腎臟、肝臟、大腦、胃腸道等多種組織中廣泛表達(dá)，在氨排泄和腎臟ph調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。但關(guān)于 rhcg基因在食管癌中的研究較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種用于食管癌診斷、治療和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒，以 rhcg基因和/或 rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域?yàn)榉肿訕?biāo)志物，利用所述分子標(biāo)志物可簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確地進(jìn)行食管癌的特異性檢測(cè)。

2、本發(fā)明提供了一種檢測(cè) rhcg基因和/或 rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域的表達(dá)量的試劑在制備食管癌診斷、輔助治療和/或預(yù)后評(píng)估產(chǎn)品中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方式中，所述 rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域所在的甲基化區(qū)域的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方式中，所述甲基化區(qū)域包括以下至少一個(gè)：由第1個(gè)至第6個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_50.70.78、由第2個(gè)至第8個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_70.78.88、由第5個(gè)至第9個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_78.88.104、由第7個(gè)至第11個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_88.104.121、由第9個(gè)至第12個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_104.121.127、由第10個(gè)至第14個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_121.127.150、由第12個(gè)至第19個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_127.150.169、由第14個(gè)至第20個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_150.169.198和由第15個(gè)至第23個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_169.198.224。

5、本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方式中，所述甲基化區(qū)域包括以下至少一個(gè)：由第9個(gè)至第12個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_104.121.127和由第10個(gè)至第14個(gè)cpg區(qū)域構(gòu)成的甲基化區(qū)域cpg_121.127.150。

6、本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方式中，所述檢測(cè) rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域的甲基化水平的試劑包括ez-96?dna?methylation-gold??kit。

7、本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方式中，所述檢測(cè) rhcg基因的表達(dá)量的試劑包括基因檢測(cè)試劑或免疫組織化學(xué)試劑。

8、本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè) rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域的表達(dá)量的引物對(duì)，包括核苷酸序列如seq?id?no.2所示的上游引物和seq?id?no.3所示的下游引物。

9、本發(fā)明提供了一種非疾病診斷目的的檢測(cè) rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域甲基化水平的方法，包括以下步驟：將上述引物對(duì)和經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的基因組dna混合配制pcr擴(kuò)增體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

10、將所述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物依次進(jìn)行蝦堿性磷酸酶處理、轉(zhuǎn)錄和酶切反應(yīng)、純化和甲基化質(zhì)譜分析，得到樣本的 rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)全部cpg位點(diǎn)甲基化水平。

11、本發(fā)明提供了一種食管癌的診斷、治療和/或預(yù)后評(píng)估的試劑盒，包括上述引物對(duì)和pcr擴(kuò)增試劑。

12、本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方式中，所述食管癌包括食管鱗狀細(xì)胞癌。

13、有益效果：本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)食管癌組織和癌旁正常組織中 rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域的表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，表明在食管癌組織中的平均甲基化水平高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)對(duì)食管鱗癌組織具有特異性，因此，以食管癌中 rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域作為新的分子標(biāo)記能夠用于診斷、輔助治療和預(yù)后評(píng)估食管癌。同時(shí)，本發(fā)明還利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)食管癌組織和癌旁正常組織中rhcg蛋白的表達(dá)情況，對(duì)食管癌組織和癌旁正常組織中rhcg蛋白的免疫組化評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)rhcg蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)采用kaplan-meier生存分析比較食管鱗癌中rhcg蛋白表達(dá)狀態(tài)與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明rhcg蛋白低表達(dá)的患者總體生存率較低（p=0.02），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受試者工作特征（receiver?operating?characteristic，roc）曲線分析，rhcg蛋白對(duì)于診斷食管鱗癌的敏感性和特異性為95.1%和75.0%，且auc的值為0.86，說(shuō)明診斷效果較好。因此，以食管鱗癌中 rhcg基因作為檢測(cè)標(biāo)志物能夠用于診斷、輔助輔助治療和預(yù)后評(píng)估。綜上，本發(fā)明提供了一種以 rhcg基因和/或 rhcg基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化區(qū)域作為檢測(cè)標(biāo)志物在制備食管癌診斷、輔助治療和/或預(yù)后評(píng)估的產(chǎn)品中的應(yīng)用。