本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種巴沙魚nat10抗菌肽及其編碼序列和用途與制備方法。

背景技術(shù)：

1、博氏巨鯰（pangasius?bocourti）俗稱巴沙魚，是?科、?屬魚類。巴沙魚具有生長(zhǎng)快、個(gè)體大、產(chǎn)量高、食性廣、易飼養(yǎng)、無(wú)肌間小刺、利于加工等特點(diǎn)，因此具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是東南亞地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)魚類。同時(shí)巴沙魚具有極強(qiáng)的低氧耐受能力和抗病能力，這也表明巴沙魚的先天性免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)大的防御能力，對(duì)其防御系統(tǒng)的進(jìn)一步研究，或可為豐富抗菌肽這一綠色資源具有潛在價(jià)值。2021年，華大海洋在國(guó)際期刊《genomics》上發(fā)表了全球首個(gè)巴沙魚染色體水平基因組。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)巴沙魚（pangasianodonhypophthalmus）進(jìn)行全基因組測(cè)序和組裝，獲得了731.7mb的染色體水平參考基因組，其contig和scaffoldn50分別為3.5mb和29.5mb。這一成果為巴沙魚的基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，不僅解析了巴沙魚的遺傳基礎(chǔ)，也為巴沙魚的功能蛋白的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。

2、抗菌肽（antimicrobial?peptides，amps）是一類具有抗菌活性的小分子多肽，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。它們是生物體內(nèi)先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠抵御外界病原體的入侵。抗菌肽的抑菌機(jī)理是：主要是通過(guò)帶正電的抗菌肽作用于細(xì)菌質(zhì)膜磷脂分子上的負(fù)電荷，使膜發(fā)生去極化或形成“孔洞”，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)作用于dna或rna，直接殺死細(xì)菌。由于抗菌肽這種特殊的作用機(jī)制使細(xì)菌來(lái)不及對(duì)這種傷害做出遺傳突變，不易產(chǎn)生超級(jí)細(xì)菌。因此，隨著全球抗生素耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，抗菌肽被視為最有潛力替代抗生素的一種綠色生物資源。

3、近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)（hts）的不斷發(fā)展，其已在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和市場(chǎng)價(jià)值；且隨著高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)、人工智能等領(lǐng)域的結(jié)合日益緊密，推動(dòng)了數(shù)據(jù)處理和分析的效率提升，在抗菌肽的預(yù)測(cè)和合成領(lǐng)域也展露了一定的作用。例如，中國(guó)專利申請(qǐng)文獻(xiàn)cn116024223a和cn115850427a公開的芋螺雙α螺旋（β折疊）抗菌肽其制備方法及其應(yīng)用，基于多組學(xué)的方法，從芋螺多組學(xué)數(shù)據(jù)集中識(shí)別抗菌肽前體基因序列，再經(jīng)翻譯設(shè)計(jì)，人工合成多條具有活性的抗菌肽氨基酸序列，為抗菌肽的獲取提供了新思路。然而，目前的從動(dòng)物中鑒定抗菌肽多從能產(chǎn)生毒液的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，例如，來(lái)自5種螞蟻的15條毒液短肽序列被報(bào)道具有抗菌活性；來(lái)自7種蜜蜂的13條毒液短肽序列被報(bào)道具有抗體活性；來(lái)自9種蛇的10條毒液短肽序列被報(bào)道具有抗體活性；來(lái)自30余種蜈蚣中發(fā)現(xiàn)了55條具有活性的抗菌肽，但從魚類中鑒定的抗菌肽并不多。

4、迄今為止，從動(dòng)物、真菌、植物和細(xì)菌中鑒定出的抗菌肽約3000多個(gè)，它們大多是由10～100個(gè)氨基酸殘基組成，且大多數(shù)的抗菌肽為陽(yáng)離子（帶正電荷）和兩親（親水或疏水）α螺旋/β折疊肽分子。但目前被鑒定具有抗菌活性的抗菌肽在生物體內(nèi)的天然存在均非常少，可以說(shuō)含量低微，這使得其分離、提純非常困難，不利于開發(fā)利用；且這些抗菌肽多存在抗菌功能單一，抗菌譜窄，抑菌效果不顯著等問(wèn)題；另外，一些抗菌肽具有一定的毒性，例如一些抗菌肽具有很高的溶血活性，用于活體消毒時(shí)導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，對(duì)生命體造成傷害。

5、nat10（n-acetyltransferase?10）是一種多功能酶，具有蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和rna乙酰轉(zhuǎn)移酶的雙重活性，廣泛參與細(xì)胞生理和病理過(guò)程?，F(xiàn)有關(guān)于nat10的功能研究，主要集中在免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分裂和衰老、dna損傷修復(fù)、以及腫瘤、自身免疫性疾病、炎癥的治療等方面，但關(guān)于其抗菌活性的研究尚未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述的現(xiàn)有的生物源抗菌肽資源不夠豐富，特別是關(guān)于巴沙魚體內(nèi)抗菌肽的研究更是少見，目前還沒(méi)有相關(guān)的抗菌肽序列被報(bào)道，以及尚未有關(guān)于nat10的抑菌功能的研究等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種巴沙魚nat10抗菌肽及其編碼序列和用途與制備方法，基于多組學(xué)的方法，從生物學(xué)大數(shù)據(jù)層面篩選從巴沙魚多組學(xué)數(shù)據(jù)集中識(shí)別抗菌肽前體基因序列，再經(jīng)翻譯設(shè)計(jì)，人工合成具有抗菌活性的巴沙魚nat10抗菌肽。經(jīng)活性模擬預(yù)測(cè)與體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該巴沙魚nat10抗菌肽對(duì)無(wú)乳鏈球菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)活性均表現(xiàn)出了抑制作用，具體技術(shù)方案如下：

2、本發(fā)明目的之一是提供一種巴沙魚nat10抗菌肽，該巴沙魚nat10抗菌肽的氨基酸序列如seq?id?no:3所示。

3、前述的巴沙魚nat10抗菌肽，含α雙螺旋結(jié)構(gòu)。

4、本發(fā)明目的之二是提供一種巴沙魚nat10抗菌肽前體，該巴沙魚nat10抗菌肽前體的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

5、本發(fā)明目的之三是提供一種巴沙魚nat10抗菌肽前體基因，該巴沙魚nat10抗菌肽前體基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

6、本發(fā)明目的之四是提供一種巴沙魚nat10抗菌肽在制備抗細(xì)菌產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述細(xì)菌包括無(wú)乳鏈球菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和對(duì)革蘭氏陰性大腸桿菌。

7、前述的巴沙魚nat10抗菌肽在制備抗細(xì)菌產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述應(yīng)用至少包括制備抑菌劑、制備藥物或制備添加劑中的一項(xiàng)。

8、前述的巴沙魚nat10抗菌肽在制備抗細(xì)菌產(chǎn)品中的應(yīng)用，用于抗金黃色葡萄球菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為2.5μmol/l及以上；用于抗革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)乳鏈球菌或革蘭氏陰性大腸桿菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為5μmol/l及以上；用于抗鰻弧菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為10μmol/l及以上；用于抗腸炎沙門氏菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為20μmol/l及以上。

9、作為優(yōu)選的技術(shù)方案的，前述的巴沙魚nat10抗菌肽在制備抗細(xì)菌產(chǎn)品中的應(yīng)用，用于制備抗金黃色葡萄球菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為2.5μmol/l～40μmol/l；用于抗革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)乳鏈球菌或革蘭氏陰性大腸桿菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為5μmol/l～40μmol/l；用于抗鰻弧菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為10μmol/l～40μmol/l；用于抗腸炎沙門氏菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為20μmol/l～40μmol/l。

10、作為優(yōu)選的技術(shù)方案的，前述的巴沙魚nat10抗菌肽在制備抗細(xì)菌產(chǎn)品中的應(yīng)用，用于活體消毒時(shí)，抗菌的產(chǎn)品中，巴沙魚nat10抗菌肽的濃度為2.5μmol/l～5μmol/l。

11、本發(fā)明目的之五是提供一種巴沙魚nat10抗菌肽的制備方法，采用同源比對(duì)從巴沙魚多組學(xué)數(shù)據(jù)集中識(shí)別抗菌肽前體基因序列，將識(shí)別的抗菌肽前體基因翻譯成抗菌肽前體蛋白，再以已知的具有抗菌活性的抗菌肽作為參考序列，對(duì)翻譯后的抗菌肽前體蛋白潛在成熟活性肽區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，獲得所述巴沙魚nat10抗菌肽氨基酸序列；所述巴沙魚多組學(xué)數(shù)據(jù)集包括巴沙魚的基因組，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集；所述巴沙魚的基因組為經(jīng)過(guò)組裝的巴沙魚t2t基因組；所述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集來(lái)自巴沙魚的眼睛、鰓、性腺、腎臟、肝臟、肌肉、皮膚和脾臟這8個(gè)組織。

12、本發(fā)明的有益效果：

13、1）本發(fā)明基于多組學(xué)的方法，從生物學(xué)大數(shù)據(jù)層面篩選從巴沙魚多組學(xué)數(shù)據(jù)集中識(shí)別抗菌肽前體基因序列，再經(jīng)翻譯設(shè)計(jì)，獲得所述巴沙魚nat10抗菌肽氨基酸序列；經(jīng)活性模擬預(yù)測(cè)與體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該巴沙魚nat10抗菌肽對(duì)無(wú)乳鏈球菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)活性表現(xiàn)出了抑制作用，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌，在2.5μmol/l濃度時(shí)即表現(xiàn)出最好的抑菌效果；對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)乳鏈球菌、革蘭氏陰性大腸桿菌，在2.5μmol/l濃度時(shí)可表現(xiàn)出良好的的抑菌效果，在5μmol/l濃度時(shí)即表現(xiàn)出最好的抑菌效果；對(duì)鰻弧菌，在5μmol/l濃度時(shí)表現(xiàn)出良好的抑菌效果，在10μmol/l濃度時(shí)即表現(xiàn)出最好的抑菌效果；即便對(duì)腸炎沙門氏菌，在20μmol/l濃度時(shí)亦即表現(xiàn)出良好的抑菌效果?？捎糜谥苽涓鞣N殺菌制劑，包括抑菌劑、藥物或添加劑等。

14、2）本發(fā)明巴沙魚nat10抗菌肽是一種新型的抗菌肽，也是首次揭露了nat10具有抗菌活性，更是首次對(duì)巴沙魚基因組深入挖掘，為抗菌肽提供了新的來(lái)源。這一寶貴的生物遺傳資源為深入開發(fā)新型海洋抗菌藥物和研究抗菌肽臨床治療應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，也進(jìn)一步豐富了現(xiàn)有的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)，為生物源的抗生素替代傳統(tǒng)抗生素的提供了更多的選擇。

15、3）本發(fā)明巴沙魚nat10抗菌肽具有較低溶血率，5μmol/l時(shí)溶血活性為5.53%，2.5μm時(shí)溶血活性幾乎為0，將濃度控制在5μmol/l及以下時(shí)可用于活體細(xì)菌的消殺，為對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖等養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康養(yǎng)殖提供更好的保證，具有良好的使用價(jià)值及社會(huì)生態(tài)價(jià)值。