本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥，具體地說，是關(guān)于針對鱗翅目昆蟲的dsrna及其農(nóng)藥組合物和用途。

背景技術(shù)：

1、小菜蛾（plutella?xylostella?l.）是一種全球性的重要農(nóng)業(yè)害蟲，主要危害十字花科蔬菜，如白菜、油菜、芥菜等。由于其繁殖速度快、適應性強，一旦發(fā)生蟲害，若防治不力，可導致作物嚴重減產(chǎn)，甚至絕收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)估計，小菜蛾每年在全球范圍內(nèi)造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元。小菜蛾產(chǎn)卵量大，每只雌蟲可產(chǎn)卵200～300粒，且世代重疊，使得防治更加困難。目前小菜蛾的防治主要依賴化學農(nóng)藥，但長期的化藥使用使得小菜蛾對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，包括有機氯、有機磷、氨基甲酸酯等，因此未來的小菜蛾防治研究應更加注重生態(tài)友好和可持續(xù)的防治策略。

2、小菜蛾屬于全變態(tài)昆蟲，一生要經(jīng)歷胚胎、幼蟲、蛹、成蟲等發(fā)育階段，在這個過程中由于幾丁質(zhì)外骨骼的限制，昆蟲必須周期性蛻皮才能完成個體生長和發(fā)育。小菜蛾的蛻皮激素（20-羥蛻皮酮，20e）在調(diào)控其生長發(fā)育和生殖過程中扮演著重要角色，因此其核受體（ecr）被認為是很好的藥物靶點，據(jù)報道，已有學者基于蛻皮激素受體的生長調(diào)節(jié)劑的研究開發(fā)有效殺蟲劑，例如商業(yè)化殺蟲劑蟲酰肼通過干擾正常的蛻皮過程來殺死一些鱗翅目和鞘翅目害蟲。

3、rna農(nóng)藥由于其高效和環(huán)境友好的特性，成為近年來的小菜蛾新型防治策略的研究熱點。它利用rna干擾（rnai）技術(shù)來特異性地沉默害蟲的關(guān)鍵基因，從而達到控制害蟲的目的。小菜蛾蛻皮激素及其相關(guān)基因是設計dsrna的潛在靶點，可用于害蟲控制策略。通過rnai技術(shù)，可以特異性地降低這些基因的表達，從而影響小菜蛾的生長發(fā)育和生殖能力。蛻皮激素受體ecr在控制昆蟲蛻皮和變態(tài)的蛻皮激素信號通路中起著至關(guān)重要的作用。用dsrna靶向ecr可以抑制甚至破壞昆蟲這一重要的發(fā)育過程。據(jù)報道，利用煙草植株表達小菜蛾的ecr-dsrna能夠增加植株對小菜蛾的抗性，而且食取了轉(zhuǎn)基因煙草葉片的小菜蛾體內(nèi)ecr表達水平顯著降低。此外，chaitanya等通過飼喂小菜蛾靶向ecr的dsrna能夠觀察到dsrna濃度與敲降水平以及致死率指標正相關(guān)，雖然該報道中飼喂?jié)舛冗_到20?μg/ul時的死亡率僅為40%左右，但仍為靶向該靶點的小菜蛾防治提供了思路。

4、小菜蛾屬于鱗翅目昆蟲，一般認為其對dsrna不敏感，主要原因為鱗翅目昆蟲腸道內(nèi)有強大的降解dsrna的酶。有學者研究了四種小菜蛾的dsrna降解酶（pxdsrnase1、pxdsrnase2、pxdsrnase3和pxdsrnase4），其中pxdsrnase1是在小菜蛾血淋巴中高表達的dsrna降解酶，其對dsrna的降解能力顯著高于其他三個酶，是影響dsrna在小菜蛾體內(nèi)穩(wěn)定性的重要因素之一。而基于噴施型核酸農(nóng)藥必須要突破dsrna降解酶的屏障才能讓小菜蛾吸收dsrna達到致死效果。因此，目前仍有待開發(fā)更加有效的針對小菜蛾的生物防治方案。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種用于高效防治小菜蛾的dsrna，旨在克服現(xiàn)有生物防治方案中小菜蛾致死率較低的問題，為小菜蛾的生物防治提供了新思路。

2、在一個方面，本發(fā)明提供了針對鱗翅目昆蟲的dsrna，其特征在于，所述針對鱗翅目昆蟲的dsrna包括正義鏈和反義鏈，其中，所述正義鏈具有如seq?id?no：5所示的核苷酸序列，所述反義鏈具有如seq?id?no：6所示的核苷酸序列。

3、在另一個方面，本發(fā)明提供了針對鱗翅目昆蟲的dsrna，其特征在于，所述針對鱗翅目昆蟲的dsrna包括正義鏈和反義鏈，其中，所述正義鏈具有如seq?id?no：1所示的核苷酸序列，所述反義鏈具有如seq?id?no：2所示的核苷酸序列。

4、在另一個方面，本發(fā)明提供了針對鱗翅目昆蟲的dsrna，其特征在于，所述針對鱗翅目昆蟲的dsrna包括正義鏈和反義鏈，其中，所述正義鏈具有如seq?id?no：3所示的核苷酸序列，所述反義鏈具有如seq?id?no：4所示的核苷酸序列。

5、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，所述表達載體包括如本文任一實施方案所述的針對鱗翅目昆蟲的dsrna的正義鏈或反義鏈。

6、優(yōu)選地，所述表達載體包括兩個或兩個以上啟動子。

7、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包括如本文任一實施方案所述的針對鱗翅目昆蟲的dsrna的正義鏈或反義鏈，或如本文任一實施方案所述的表達載體。

8、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種制備如本文任一實施方案所述的針對鱗翅目昆蟲的dsrna的方法，所述方法包括使用如本文任一實施方案所述的表達載體進行表達，或使用如本文任一實施方案所述的宿主細胞進行表達。

9、優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

10、s1：提取小菜蛾的rna；

11、s2：以小菜蛾的rna為模板反轉(zhuǎn)錄得到cdna；

12、s3：以cdna為模板，通過pcr擴增目標序列；

13、s4：將目標序列克隆至質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒載體；

14、s5：將重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞，以轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒載體的感受態(tài)細胞為宿主細胞；

15、s6：培養(yǎng)宿主細胞，用誘導劑誘導宿主細胞表達針對鱗翅目昆蟲的dsrna，得到發(fā)酵液；

16、s7：提純發(fā)酵液中的針對鱗翅目昆蟲的dsrna。

17、更優(yōu)選地，步驟s1中，所述提取的方法為trizol法。

18、更優(yōu)選地，步驟s3中，所述目標序列選自seq?id?no：9～14中任一項。

19、更優(yōu)選地，步驟s4中，所述克隆的步驟包括：

20、s4-1：用特異性核酸內(nèi)切酶處理質(zhì)粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳純化得到線性化質(zhì)粒；

21、s4-2：將s3中pcr擴增的產(chǎn)物與線性化質(zhì)粒用dna連接酶連接，得到重組質(zhì)粒載體。

22、進一步優(yōu)選地，步驟s4-1中，所述特異性核酸內(nèi)切酶為ecori內(nèi)切酶。

23、進一步優(yōu)選地，步驟s4-1中，所述重組質(zhì)粒載體包括兩個或兩個以上啟動子。

24、更優(yōu)選地，步驟s5中，所述感受態(tài)細胞為ht115（de3）。

25、更優(yōu)選地，步驟s6中，所述誘導劑為iptg。

26、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種農(nóng)藥組合物，所述農(nóng)藥組合物包括有效量的如本文任一實施方案所述的針對鱗翅目昆蟲的dsrna，和農(nóng)藥可接受的載體、溶劑或賦形劑。

27、優(yōu)選地，所述載體選自脂質(zhì)體，聚合物納米粒，乳劑，混懸劑，無機納米粒，有機/無機雜化納米粒和碳量子點。

28、更優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體包括非磷脂類脂質(zhì)體。更優(yōu)選地，所述聚合物納米粒包括殼聚糖。更優(yōu)選地，所述無機納米粒包括氨基修飾介孔二氧化硅或?qū)訝铍p氫氧化物（ldh）。

29、優(yōu)選地，所述農(nóng)藥組合物中，dsrna的濃度為1～5000ng/μl。更優(yōu)選地，所述農(nóng)藥組合物中，dsrna的濃度為50～3000ng/μl。進一步優(yōu)選地，所述農(nóng)藥組合物中，dsrna的濃度為100～2500ng/μl。

30、在一個或多個實施方案中，所述農(nóng)藥組合物包括靶向鱗翅目昆蟲的ecr基因和dsrnase1基因的dsrna。

31、優(yōu)選地，所述農(nóng)藥組合物包括包括正義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：1所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：2所示的dsrna，和正義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：3所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：4所示的dsrna。

32、優(yōu)選地，所述農(nóng)藥組合物包括正義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：5所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：6所示的dsrna。

33、在一個或多個實施方案中，所述農(nóng)藥組合物還包括一種或多種其他農(nóng)藥。

34、優(yōu)選地，所述其他農(nóng)藥選自雙酰肼類農(nóng)藥，阿維菌素和多殺菌素。

35、更優(yōu)選地，所述其他農(nóng)藥為雙酰肼類農(nóng)藥。更優(yōu)選地，所述農(nóng)藥組合物包括正義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：1所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：2所示的dsrna，和正義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：3所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：4所示的dsrna；所述其他農(nóng)藥為雙酰肼類農(nóng)藥。更優(yōu)選地，所述農(nóng)藥組合物包括正義鏈的核苷酸序列如seqid?no：5所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no：6所示的dsrna；所述其他農(nóng)藥為雙酰肼類農(nóng)藥。

36、進一步優(yōu)選地，所述雙酰肼類農(nóng)藥選自甲氧蟲酰肼，蟲酰肼，呋喃蟲酰肼，環(huán)蟲酰肼和氯蟲酰肼中一種或多種的組合。

37、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種制備如本文任一實施方案所述的農(nóng)藥組合物的方法，所述方法包括向溶劑中加入如本文任一實施方案所述的針對鱗翅目昆蟲的dsrna和農(nóng)藥可接受的載體、溶劑或賦形劑。

38、優(yōu)選地，所述方法還包括加入其他農(nóng)藥。優(yōu)選地，所述其他農(nóng)藥選自雙酰肼類農(nóng)藥，阿維菌素和多殺菌素。更優(yōu)選地，所述其他農(nóng)藥為雙酰肼類農(nóng)藥。進一步優(yōu)選地，所述雙酰肼類農(nóng)藥選自甲氧蟲酰肼，蟲酰肼，呋喃蟲酰肼，環(huán)蟲酰肼和氯蟲酰肼。

39、在另一個方面，本發(fā)明提供了如本文任一實施方案所述的針對鱗翅目昆蟲的dsrna在制備用于防治鱗翅目昆蟲的農(nóng)藥中的用途。

40、在另一個方面，本發(fā)明提供了如本文任一實施方案所述的農(nóng)藥組合物在制備用于防治鱗翅目昆蟲的農(nóng)藥中的用途。

41、優(yōu)選地，所述鱗翅目昆蟲為菜蛾科昆蟲。更優(yōu)選地，所述菜蛾科昆蟲為小菜蛾。

42、本發(fā)明提供的針對鱗翅目昆蟲的dsrna及其農(nóng)藥組合物，相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下至少一點有益效果：

43、1、設計靶向小菜蛾生理過程中的重要靶點ecr的dsrna，成功實現(xiàn)靶標基因表達下降，以及小菜蛾死亡率的提升。

44、2、分別設計靶向小菜蛾ecr和dsrnase1的dsrna，并混合施用，成功實現(xiàn)雙靶標基因表達下降，同時，相比于單靶干擾ecr，雙靶干擾混合施用協(xié)同顯著提升了小菜蛾死亡率。

45、3、設計了同時靶向ecr和dsrnase1的dsrna，成功實現(xiàn)雙靶標基因表達下降，同時，相比于單靶干擾ecr，雙靶干擾協(xié)同提升了小菜蛾死亡率（可達83%），且效果優(yōu)于雙靶干擾混合施用。

46、4、本發(fā)明提供的dsrna與低毒的雙酰肼類農(nóng)藥復配，對于小菜蛾產(chǎn)生了協(xié)同的致死效果和致羽化異常效果，對于致羽化異常效果而言尤為明顯。

47、5、本發(fā)明提供的dsrna能夠?qū)崿F(xiàn)較高的小菜蛾死亡率，而作為rna類生物農(nóng)藥，相比于傳統(tǒng)的化學農(nóng)藥，又具有優(yōu)異的可降解性，有利于小菜蛾的生物防治的推廣和應用。