本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)，特別涉及一種小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

1、少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，近年來多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中可能具有關(guān)鍵作用。小鼠是目前最佳的研究少突膠質(zhì)細(xì)胞與疾病關(guān)系的模式動(dòng)物，但小鼠原代少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)難點(diǎn)始終沒有突破，這使得少突膠質(zhì)細(xì)胞領(lǐng)域的研究進(jìn)度緩慢，因此有必要建立一種簡單而高效的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法。小鼠原代少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)主要有兩個(gè)難點(diǎn)：培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基配方。已有的培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)基配方均基于大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)所開發(fā)，其培養(yǎng)的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞存活率低，難以獲得大量細(xì)胞，因此該方法無法在國內(nèi)大規(guī)模推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法和優(yōu)化培養(yǎng)基，以解決已有的培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)基培養(yǎng)的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞存活率低，難以獲得大量細(xì)胞的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

4、一種小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

5、（1）對細(xì)胞培養(yǎng)皿依次進(jìn)行多聚賴氨酸和層粘連蛋白預(yù)處理；

6、（2）將小鼠大腦皮層經(jīng)胰酶消化、吹打組織使其分解為單細(xì)胞，利用胎牛血清終止胰酶消化，并放入離心機(jī)進(jìn)行離心；

7、（3）離心后吸去上清液，加入液體培養(yǎng)基，對沉淀進(jìn)行吹打使其恢復(fù)單細(xì)胞狀態(tài)，過濾，去除組織碎片，獲得單細(xì)胞懸液；

8、（4）將單細(xì)胞懸液離心后使用少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分選試劑盒進(jìn)行分選，獲得純化的小鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，并以液體培養(yǎng)基在步驟（1）預(yù)處理過的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；

9、（5）去除液體培養(yǎng)基，加入少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)以擴(kuò)增細(xì)胞量；

10、（6）當(dāng)需要獲得新分化少突膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，將少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)基去除，加入少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基，獲得新分化少突膠質(zhì)細(xì)胞；

11、（7）當(dāng)需要獲得成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，將新分化少突膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。

12、優(yōu)選的，步驟（1）中，對細(xì)胞培養(yǎng)皿以濃度0.1mg/ml的多聚賴氨酸溶液在37℃下處理1小時(shí)，蒸餾水清洗多次后晾干。

13、優(yōu)選的，多聚賴氨酸的分子量為15-30萬。

14、優(yōu)選的，步驟（1）中，細(xì)胞培養(yǎng)皿經(jīng)多聚賴氨酸處理后，再以濃度10ug/ml的層粘連蛋白溶液在室溫下處理30分鐘以上，晾干后備用。

15、優(yōu)選的，步驟（2）中，小鼠大腦皮層由以下步驟得到：在無菌條件下對出生后2-7天的已死亡小鼠進(jìn)行解剖，分離得到小鼠大腦皮層。

16、優(yōu)選的，步驟（2）中，胰酶的質(zhì)量體積濃度為0.25%。

17、優(yōu)選的，步驟（2）中，胰酶消化時(shí)間為40分鐘。

18、優(yōu)選的，步驟（2）中，吹打組織次數(shù)為10-15次。

19、優(yōu)選的，步驟（3）中，液體培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的dmem/f12（1:1）液體培養(yǎng)基。

20、優(yōu)選的，步驟（3）中，過濾采用孔徑70μm的細(xì)胞濾網(wǎng)。

21、優(yōu)選的，步驟（4）中，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分選試劑盒為美天旎公司的pdgfrα分選磁珠試劑盒。

22、優(yōu)選的，步驟（4）中，液體培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的dmem/f12（1:1）液體培養(yǎng)基。

23、優(yōu)選的，步驟（4）中，培養(yǎng)時(shí)間為30分鐘。

24、優(yōu)選的，步驟（5）中，所述少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)基的組成為：

25、以dmem/f12（1:1）和neurobasala液體培養(yǎng)基以體積比1:1混合，并加入體積比2%的sm1神經(jīng)補(bǔ)充劑、體積比1%的glutamax補(bǔ)充劑、4.2μg/ml毛喉素forskolin、10ng/ml睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子cntf、10ng/ml血小板衍生生長因子pdgf-aa、1ng/ml神經(jīng)營養(yǎng)因子-3?nt-3。

26、優(yōu)選的，步驟（6）中，所述少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基的組成為：

27、以dmem/f12（1:1）和neurobasala液體培養(yǎng)基體積比1:1混合，并加入體積比2%的sm1神經(jīng)補(bǔ)充劑、體積比1%的glutamax補(bǔ)充劑、4.2μg/ml毛喉素forskolin、10ng/ml睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子cntf、40ng/ml三碘甲狀腺原氨酸t(yī)3。

28、優(yōu)選的，步驟（6）中，需少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在所述少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)以得到新分化少突膠質(zhì)細(xì)胞。

29、優(yōu)選的，步驟（7）中，將少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-10天。

30、在一些實(shí)施例中，通過上述步驟（1）-（5），獲得了少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。

31、在一些實(shí)施例中，通過上述步驟（1）-（6），獲得了大量少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。

32、在一些實(shí)施例中，通過上述步驟（1）-（7），獲得了成熟少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。

33、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)基。

34、一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)基，用于使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞維持當(dāng)前細(xì)胞階段并快速增殖獲得大量細(xì)胞，其組成為：

35、以dmem/f12（1:1）和neurobasala液體培養(yǎng)基以體積比1:1混合，并加入體積比2%的sm1神經(jīng)補(bǔ)充劑、體積比1%的glutamax補(bǔ)充劑、4.2μg/ml毛喉素forskolin、10ng/ml睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子cntf、10ng/ml血小板衍生生長因子pdgf-aa、1ng/ml神經(jīng)營養(yǎng)因子-3?nt-3。

36、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基。

37、一種少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基，用于使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化，其組成為：

38、以dmem/f12（1:1）和neurobasala液體培養(yǎng)基體積比1:1混合，并加入體積比2%的sm1?神經(jīng)補(bǔ)充劑、體積比1%的glutamax補(bǔ)充劑、4.2μg/ml毛喉素forskolin、10ng/ml睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子cntf、40ng/ml三碘甲狀腺原氨酸t(yī)3。

39、有益效果：本發(fā)明用多聚賴氨酸和層粘連蛋白共同處理，搭配dmem/f12（1:1）和neurobasala液體培養(yǎng)基，以及毛喉素forskolin和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子cntf，可從多方面提高小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞存活率，同時(shí)以血小板衍生生長因子pdgf-aa和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3?nt-3控制少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，而三碘甲狀腺原氨酸t(yī)3控制少突膠質(zhì)細(xì)胞分化階段，從而使得研究者可以快速獲得大量所需發(fā)育階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究，加速突破不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷及治療難點(diǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（1）中，對細(xì)胞培養(yǎng)皿以濃度0.1mg/ml的多聚賴氨酸溶液在37℃下處理1小時(shí)，蒸餾水清洗多次后晾干，其中多聚賴氨酸的分子量為15-30萬；然后再以濃度10ug/ml的層粘連蛋白溶液在室溫下處理30分鐘以上，晾干后備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（2）中，小鼠大腦皮層由以下步驟得到：在無菌條件下對出生后2-7天的已死亡小鼠進(jìn)行解剖，分離得到小鼠大腦皮層；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（3）中，液體培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的dmem/f12（1:1）液體培養(yǎng)基；

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（4）中，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分選試劑盒為美天旎公司的pdgfrα分選磁珠試劑盒；

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（6）中，所述少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基的組成為：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（6）中，需少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在所述少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)以得到新分化少突膠質(zhì)細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（7）中，將少突膠質(zhì)前體細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-10天。

9.一種少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)基，用于使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞維持當(dāng)前細(xì)胞階段并快速增殖獲得大量細(xì)胞，其特征在于：其組成為：

10.一種少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基，用于使少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化，其特征在于：其組成為：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法包括以下步驟：對細(xì)胞培養(yǎng)皿依次進(jìn)行多聚賴氨酸和層粘連蛋白預(yù)處理；將小鼠大腦皮層分解為單細(xì)胞；離心后吸去上清液，加入液體培養(yǎng)基，對沉淀進(jìn)行吹打使其恢復(fù)單細(xì)胞狀態(tài)，過濾，獲得單細(xì)胞懸液；將單細(xì)胞懸液離心后進(jìn)行分選，獲得純化的小鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，并在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；加入少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)以擴(kuò)增細(xì)胞量；將少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖培養(yǎng)基去除，加入少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基，獲得新分化少突膠質(zhì)細(xì)胞；將新分化少突膠質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明能夠使得研究者可以快速獲得大量所需發(fā)育階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究。

技術(shù)研發(fā)人員：陶艷梅,胡旭
受保護(hù)的技術(shù)使用者：東南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15