本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉病毒抗原融合蛋白及其應用，尤其涉及由豬流行性腹瀉病毒刺突蛋白和單體豬鐵蛋白重鏈亞基融合在一起的豬流行性腹瀉病毒抗原融合蛋白以及由該豬流行性腹瀉病毒抗原融合蛋白制備的豬流行性腹瀉疫苗，屬于豬流行性腹瀉疫苗的制備和應用領域。

背景技術：

1、近年來，生豬的養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，給疾病預防工作帶來巨大壓力。豬流行性腹瀉（ped）是由豬流行性腹瀉病毒（pedv）引發(fā)的一種仔豬嚴重的腸道疾病，會造成仔豬嚴重的嘔吐、腹瀉、脫水，有著極高的死亡率。pedv屬于α冠狀病毒屬的單鏈rna病毒，有包膜包被，其基因組全長約為28kb，包含四個結構蛋白—刺突蛋白（spike，s）、核衣殼蛋白（nucleocapsid，n）、膜蛋白（membrane，m）、包膜蛋白（envelope?glycoprotein，e）以及三個開發(fā)式閱讀框編碼非結構蛋白nsp1-nsp16。防治pedv的最好的工具主要是疫苗，刺突蛋白是與特定的宿主細胞的糖蛋白相互作用同時介導病毒進入宿主細胞的關鍵蛋白，因此刺突蛋白部分是研制疫苗時的關鍵部分。

2、天然鐵蛋白由內核和蛋白外殼兩部分組成，在細菌、植物和動物中發(fā)現(xiàn)的鐵蛋白均由24個亞基組成，其中每3個亞基組成一個三聚體亞單位，8個三聚體可形成外徑12?nm、內腔直徑為8?nm的球形籠狀結構，同時鐵蛋白非常穩(wěn)定，能夠耐受高溫和多種變性劑而不影響其天然蛋白結構。鐵蛋白由于其可以通過化學方法和基因融合進行修飾的特性使其成為理想的多功能納米載體，其高度有序重復抗原在微生物體表面以5-10?nm間隔分布時易于誘導產生強烈的t細胞依賴的抗體反應。而由24個亞基自組裝而成的鐵蛋白納米顆粒正式成為一個理想的抗原呈遞和疫苗開發(fā)平臺。

3、豬鐵蛋白可減少用于豬的疫苗中非抗原部分引起的免疫反應，減少機體產生的炎癥反應。pedv的刺突蛋白s具有天然的三聚體結構，鐵蛋白的三聚體亞單位可以很好的模擬天然病毒的結構，因此利用pedv?s蛋白和鐵蛋白連接制成的疫苗具有很好的應用前景。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供pedv?s蛋白的同感序列。

2、本發(fā)明的目的之二是提供包含pedv?s蛋白的抗原融合蛋白。

3、本發(fā)明的目的之三是提供將所述的抗原融合蛋白進行突變得到的表達量提高或效價提升的突變體。

4、本發(fā)明的目的之四是提供所述的融合蛋白以及所述的融合蛋白的突變體的編碼基因。

5、本發(fā)明目的之五是將所述的編碼基因應用于制備pedv自組裝鐵蛋白納米抗原顆?；蛑苽鋚edv疫苗等方面。

6、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的主要技術方案包括：

7、本發(fā)明的一方面是提供pedv?s蛋白的同感序列，其氨基酸序列為seq?id?no.1所示。

8、本發(fā)明通過分析20條最近年份、流行于不同地區(qū)的pedv毒株的s蛋白氨基酸序列進行比對分析，找出一條最為通用的同感序列，該同感序列的氨基酸序列為seq?id?no.1所示，作為相應毒株的抗原基因，以取得最佳的免疫保護效果。

9、本發(fā)明的另一方面是提供一種包含pedv?s蛋白的抗原融合蛋白。

10、本發(fā)明的一種具體實施方案，所述的抗原融合蛋白是由pedv?s蛋白與鐵蛋白單體通過連接肽連接得到。

11、對pedv?s蛋白的氨基酸序列進行分析后，得出pedv?s蛋白其跨膜區(qū)為1328-1350位，有23個氨基酸組成，其胞外結構域為1327個氨基酸；信號肽區(qū)域為1-18位。將pedv?s蛋白的氨基酸序列去除跨膜區(qū)和胞內區(qū)，將鐵蛋白去除前18個氨基酸，將處理后的pedv?s蛋白和單體鐵蛋白亞基的n端通過sgg連接；其中，所述的單體豬鐵蛋白的氨基酸序列為seqidno.2所示；

12、在此基礎上，本發(fā)明進一步利用optimumgenetm技術對融合蛋白氨基酸序列進行優(yōu)化，將優(yōu)化后的s蛋白氨基酸序列和鐵蛋白單體亞基氨基酸序列根據(jù)家蠶密碼子偏好性對氨基酸序列進行改造，所得到的抗原融合蛋白的氨基酸序列為seq?id?no.3所示，其編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no.4所示。

13、進一步的，對seq?id?no.3所示的抗原融合蛋白的序列分析過程中發(fā)現(xiàn)該序列的信號肽有多個切割峰，鑒于之前信號肽的切割位點影響外源蛋白表達效率的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明決定對seq?id?no.3所示的抗原融合蛋白序列信號肽區(qū)域進行突變。從ncbi上搜集大量哺乳動物和昆蟲蛋白的氨基酸序列，利用signalp4.1在線對這些序列進行信號肽預測，結果發(fā)現(xiàn)蜂素蛋白的信號肽效果最好，故據(jù)此，以蜂素蛋白的信號肽氨基酸序列為基準，對該序列信號肽區(qū)域進行改造；具體的，將原序列第19-20位氨基酸亮氨酸、脯氨酸（l、p）刪除，替換為酪氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸(y、i、y、a)，得到優(yōu)化序列的抗原融合蛋白氨基酸序列為seq?id?no.7所示，其編碼基因的核苷酸為seq?id?no.8所示。

14、本發(fā)明人還對pedv?s蛋白上的抗原表位進行了預測，將一段預測表位肽段、六段b細胞線性表位肽段和兩段通用t細胞表位肽段利用ggssgg作為linker進行連接，再通過連接肽sgg連接在單體鐵蛋白亞基的n端，形成只針對表位部分的抗原融合蛋白，其氨基酸序列為seq?id?no.5所示，其編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no.6所示。

15、本發(fā)明的另一方面是提供將所述的抗原融合蛋白進行突變得到的表達量或效價提升的突變體。

16、本發(fā)明的一種優(yōu)選的具體實施方案，所述的抗原融合蛋白的突變體是將seq?idno.3所示的氨基酸序列的第19-20位氨基酸亮氨酸、脯氨酸（l、p）刪除，替換為酪氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸(y、i、y、a)；其中，所述的突變體的氨基酸序列為seq?id?no.7所示。

17、為了進一步提高氨基酸序列為seq?id?no.7所示的抗原融合蛋白的表達量或效價，本發(fā)明進一步將seq?id?no.7所示的氨基酸序列按照l55f、p131q、a158e、s179h、m206a、d225n、g255t、v283i、y293l、t304d、l332v、p365l、r398k或n411d中的任何一種氨基酸單位點突變方式獲得單位點突變體；所獲得的單位點突變體相比于seq?id?no.7所示的突變體的表達量或效價有明顯提高。

18、本發(fā)明所述單位點突變體“l(fā)55f”表示將氨基酸序列為seq?id?no.7所示的抗原融合蛋白的第55位氨基酸由亮氨酸（l）突變成苯丙氨酸（f）；本發(fā)明其余的單位點突變的表述依此類推。

19、為了進一步提高氨基酸序列為seq?id?no.7所示的抗原融合蛋白的表達量或效價，本發(fā)明進一步將seq?id?no.7所示的氨基酸序列按照a158e-d225n-g255t、a158e-t304d-l332v、d225n-g255t-l332v、d225n-g255t-p365l或a158e-l332v-p365l中的任何一種氨基酸多位點突變方式獲得的多位點突變體；所獲得的多位點突變體相比于seq?idno.7所示的突變體的表達量或效價均有不同程度的顯著提高。

20、本發(fā)明所述多位點突變體“a158e-d225n-g255t”表示同時將氨基酸序列為seq?idno.7所示的抗原融合蛋白的第158位氨基酸由丙氨酸（a）突變成谷氨酸（e）、第225位氨基酸由天冬氨酸（d）突變成天冬酰胺（n）以及第255位氨基酸由甘氨酸（g）突變成蘇氨酸（t）；本發(fā)明其余的多位點突變的表述依此類推。

21、本發(fā)明的另一方面是提供所述的抗原融合蛋白、所述的抗原融合蛋白的突變體的編碼基因。

22、本發(fā)明將所述抗原融合蛋白的編碼基因或抗原融合蛋白的突變體的編碼基因在家蠶表達系統(tǒng)中進行表達，表達產物經(jīng)過初步純化后采用電鏡進行觀察，觀察結果可見產物大小與預期符合的納米顆粒，籠狀體的直徑為12納米左右，仔細觀察可見有天線狀突出。

23、本發(fā)明的另一方面是將所述的編碼基因應用于制備pedv自組裝鐵蛋白納米抗原顆?；蛑苽鋚edv疫苗。

24、作為參考，本發(fā)明提供了采用真核表達系統(tǒng)在真核細胞中表達所述的抗原融合蛋白的編碼基因得到pedv自組裝鐵蛋白納米抗原顆粒的方法：將所述的抗原融合蛋白或突變體的編碼基因克隆到桿狀病毒重組載體中構建得到重組桿狀病毒重組載體；將重組桿狀病毒重組載體與桿狀病毒dna共轉染昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒；將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主或昆蟲細胞，培養(yǎng)被感染的昆蟲細胞或昆蟲宿主表達相應的抗原，純化即得。

25、本發(fā)明進一步提供了一種防治pedv的疫苗，包括：預防或治療上有效量的所述的pedv?s蛋白的同感序列、所述的pedv抗原融合蛋白、所述的pedv抗原融合蛋白的突變體、或所述的pedv抗原融合蛋白的突變體的單位點突變體或多位點突變體以及藥學上可接受的免疫佐劑和載體。

26、本發(fā)明的pedv疫苗可通過各種途徑使用，如肌內、皮下、鼻內、局部、舌下、或口服。

27、本發(fā)明可在豬鐵蛋白籠形結構表面展示pedvs蛋白抗原蛋白結構，小鼠免疫結果顯示pedv?s蛋白抗原引起的中和性抗pedv抗體效價不低于對照。本發(fā)明提供的表位肽抗原決定簇可引起中和性抗pedv抗體，表位肽抗原決定簇在不同毒株中序列保守可增加疫苗的免疫范圍，能免疫不同年份不同遺傳支系的pedv。

28、本發(fā)明篩選得到pedv?s蛋白的同感序列并將其與單體豬鐵蛋白重鏈亞基融合得到融合蛋白。為了提高融合蛋白的表達量或效價，對得到的融合蛋白進行序列優(yōu)化后再進行單位點或多位點突變，所得到的突變體的表達量或效價顯著提高。本發(fā)明利用原核表達系統(tǒng)、家蠶及acmnpv-昆蟲細胞真核表達系統(tǒng)表達重組蛋白。本發(fā)明所提供的疫苗通過在豬鐵蛋白籠形結構表面展示pedv?s蛋白，引起廣泛中和性抗pedv抗體。本發(fā)明在疫苗制備過程不涉及到活的有害病毒，相比傳統(tǒng)的減毒活疫苗方法操作更加安全、簡便，適合進行快速大規(guī)模生產；可以誘導具有廣譜性質的pedv抗體，為制備一種pedv疫苗打下基礎；接種動物而誘導產生的抗pedv抗體水平明顯比傳統(tǒng)疫苗高。

29、本發(fā)明所涉及到的術語定義

30、除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。

31、詞語“抗原”和“免疫原”可互換使用，且是指能夠誘導特異性體液(抗體)和細胞免疫應答的分子、物質、蛋白質、糖蛋白、或活病毒。

32、術語“免疫應答”是指針對抗原、疫苗或感染因子的體液或抗體介導的和細胞介導的免疫應答；術語?“疫苗”是指用于針對感染性或非感染性疾病的治療性處理或預防性免疫的?包括抗原的組合物；術語“免疫”是指通過接種疫苗或感染產生的免疫應答，其提供針對感染性或外來?試劑的保護。術語“效力”是指如通過指定的效力測定測量的在抗原制劑或疫苗中抗原的量。

33、術語“突變”和“突變體”在此具有它們的常用含義，指的是在核酸或多肽序列中的遺傳的、天然存在的或引入的變化，它們的意義與本領域人員通常所知的意義相同。

34、術語“宿主細胞”或“重組宿主細胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。

35、術語“轉染”指真核細胞由于外源dna摻入而獲得新的遺傳標志的過程。