本發(fā)明屬于動(dòng)物疫苗與獸用生物制品，具體涉及一種線性共價(jià)閉合dna疫苗及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、傳染性造血器官壞死病(infectious?hematopoietic?necrosis，簡(jiǎn)稱ihn)是一種由傳染性造血器官壞死病毒(ihnv)引起的嚴(yán)重魚(yú)類疾病。該病毒屬于彈狀病毒科(rhabdoviridae)，主要感染虹鱒(oncorhynchus?mykiss)等冷水魚(yú)類。其發(fā)病癥狀主要為體色變暗、眼球突出、腹部膨大、鰓蓋充血、游動(dòng)異常以及內(nèi)臟出血等。ihn的致死率非常高，尤其是在幼魚(yú)和魚(yú)苗階段，死亡率可達(dá)80％至100％，感染后的魚(yú)類通常在2至3周內(nèi)大量死亡。

2、ihnv病毒呈子彈形，直徑約為45～100納米，長(zhǎng)度為100～430納米。病毒顆粒由包膜和核衣殼組成，表面有密集分布的刺突。其基因組為非分段的負(fù)鏈單股rna，長(zhǎng)度約為11,000個(gè)核苷酸，編碼六種蛋白質(zhì)：核蛋白(n)、磷蛋白(p)、基質(zhì)蛋白(m)、糖蛋白(g)、非病毒蛋白(nv)和聚合酶(l)。其中糖蛋白(g)是主要抗原蛋白，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，并在病毒的感染過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，包括識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞受體等。因此，糖蛋白(g)成為dna疫苗中的最主要的抗原表達(dá)蛋白。

3、dna疫苗是一種新型疫苗技術(shù)，起源于20世紀(jì)90年代。它是繼減毒疫苗和基因工程疫苗之后的第三代疫苗。dna疫苗通過(guò)將含有外源抗原編碼基因的質(zhì)粒dna直接導(dǎo)入人體或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達(dá)抗原蛋白。這些抗原蛋白隨后被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別，激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。這種過(guò)程類似于病原微生物感染或減毒活疫苗接種，因此dna疫苗能夠有效地激發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。由于dna疫苗不含活病原體，避免了傳統(tǒng)疫苗可能引起的感染風(fēng)險(xiǎn)，具備高安全性的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)由于質(zhì)粒dna可以通過(guò)細(xì)菌大量生產(chǎn)以及常溫儲(chǔ)存運(yùn)輸，成本低穩(wěn)定性好。但由于質(zhì)粒dna骨架上存在著細(xì)菌來(lái)源的抗生素抗性基因相關(guān)序列以及原核復(fù)制序列，存在著外源基因的整合以及不良反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)。

4、端粒酶優(yōu)化質(zhì)粒骨架技術(shù)是一種利用端粒酶(telomerase)來(lái)優(yōu)化質(zhì)粒骨架的技術(shù)。端粒酶是一種能夠延長(zhǎng)染色體末端端粒的酶，主要由rna和蛋白質(zhì)組成。它通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄作用，將rna模板上的核苷酸序列添加到染色體末端，從而延長(zhǎng)端粒，保護(hù)染色體免受損傷。

5、端粒酶優(yōu)化質(zhì)粒骨架技術(shù)的核心是利用端粒酶的延長(zhǎng)作用，將質(zhì)粒dna的末端進(jìn)行修飾和優(yōu)化。當(dāng)質(zhì)粒被通過(guò)改造插入相應(yīng)的端粒酶識(shí)別位點(diǎn)，并與端粒酶在一定條件下進(jìn)行孵育，質(zhì)粒將會(huì)在端粒酶的作用下，從端粒酶特異性識(shí)別位點(diǎn)處進(jìn)行切割，并進(jìn)行端粒延長(zhǎng)，從而在特異性識(shí)別位點(diǎn)處生成線性閉合的末端端粒結(jié)構(gòu)，當(dāng)質(zhì)粒存在兩個(gè)特異性識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，經(jīng)過(guò)酶切處理后，便得到末端共價(jià)閉合的線性dna片段。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于相關(guān)質(zhì)粒骨架的優(yōu)化過(guò)程中，其中touchlight公司通過(guò)端粒酶對(duì)質(zhì)粒骨架進(jìn)行優(yōu)化，去除無(wú)關(guān)的冗余序列，并結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，可以高效合成相關(guān)線性閉合dna(us11384388?b2)。

6、經(jīng)過(guò)端粒酶優(yōu)化后的質(zhì)粒，去除了無(wú)關(guān)的抗生素抗性基因，僅僅保留相關(guān)應(yīng)用的功能元件，例如順?lè)醋有蛄械?。與傳統(tǒng)的dna質(zhì)粒相比，線性共價(jià)閉合dna在具備相當(dāng)表達(dá)效率的同時(shí)，因不含抗生素抗性基因，減少了潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，且具備更高的堿基利用率。如walters等人針對(duì)流感病毒dna疫苗進(jìn)行骨架優(yōu)化，顯示出線性共價(jià)閉合dna具備普通dna疫苗同等的免疫效果(walters?aa,kinnear?e,shattock?rj,mcdonald?ju,caproni?lj,porter?n,tregoning?js.comparative?analysis?of?enzymatically?produced?novellinear?dna?constructs?with?plasmids?for?use?as?dna?vaccines.genether.2014jul；21(7):645-52.doi:10.1038/gt.2014.37.epub2014may?15.pmid:24830436；pmcid:pmc4082409.)。conforti?a等人通過(guò)sars-cov-2受體結(jié)合域的線性dna在貓?bào)w內(nèi)的實(shí)驗(yàn)，表明無(wú)原核以及抗生素抗性基因核酸片段的線性dna具備較高的安全性，對(duì)貓進(jìn)行接種后，均未出現(xiàn)不良反應(yīng)(conforti?a,sanchez?e,salvatori?e,lione?l,compagnone?m,pinto?e,palombo?f,d'acunto?e,muzi?a,roscilli?g,sun?y,viscount?b,hayward?j,shorrock?c,diel?dg,impellizeri?ja,aurisicchio?l.a?linear?dnaencoding?the?sars-cov-2receptor?binding?domain?elicits?potent?immune?responseand?neutralizing?antibodies?in?domestic?cats.mol?ther?methods?clindev.2023mar?9；28:238～248.doi:10.1016/j.omtm.2022.12.015.epub?2023jan?2.pmid:36618106；pmcid:pmc9806924.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，例如目前虹鱒ihnv病毒所導(dǎo)致的傳染性造血器官壞死病所帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，以及傳統(tǒng)dna疫苗存在的原核序列以及抗生素抗性基因所帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，本發(fā)明提供了一種無(wú)冗余序列、僅含dna疫苗必須元件的線性共價(jià)閉合dna疫苗及其制備方法、應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面提供了一種線性共價(jià)閉合dna疫苗，其主要特點(diǎn)是，包括含ihnv病毒抗原表達(dá)單元的質(zhì)粒載體，所述的抗原表達(dá)單元序列如seq?idno.1所示，dna結(jié)構(gòu)形式為線性末端共價(jià)閉合形式。

3、較佳地，所述的質(zhì)粒載體使用pvax1質(zhì)粒。

4、較佳地，所述的質(zhì)粒載體含cpg基序，如seq?id?no.4所示。

5、本發(fā)明提供了一種感受態(tài)細(xì)胞，包括含ihnv病毒抗原表達(dá)單元的質(zhì)粒載體，所述的抗原表達(dá)單元序列如seq?id?no.1所示，優(yōu)選為stbl3感受態(tài)細(xì)胞。

6、本發(fā)明的第二方面還提供了一種線性共價(jià)閉合dna疫苗的制備方法，其主要特點(diǎn)是，包含以下步驟：

7、(1)將含ihnv病毒抗原表達(dá)單元的質(zhì)粒載體進(jìn)行端粒酶識(shí)別位點(diǎn)的插入改造，所述的抗原表達(dá)單元序列如seq?id?no.1所示；

8、(2)將步驟1所得質(zhì)粒載體進(jìn)行線性化；

9、(3)對(duì)步驟2所得線性化質(zhì)粒載體進(jìn)行端粒酶酶切；

10、(4)對(duì)步驟3所得產(chǎn)物進(jìn)行核酸外切酶消化，并進(jìn)行醇沉純化回收。

11、較佳地，在所述的步驟(1)中，端粒酶識(shí)別位點(diǎn)為telrl，序列如seq?id?no.2；在所述的步驟(2)中，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切或pcr線性擴(kuò)增進(jìn)行線性化；在所述的步驟(3)中，所用端粒酶為teln；在所述的步驟(4)中，核酸外切酶為t5核酸外切酶。

12、較佳地，所述的步驟(1)具體為：以pvax1為原始質(zhì)粒載體，于pvax1質(zhì)粒載體的t7啟動(dòng)子序列以及sv40?poly(a)signal序列之間插入所述的ihnv病毒g蛋白截短序列并附帶cpg基序，所得質(zhì)粒命名為pvax1-g-cpg；在質(zhì)粒pvax1-g-cpg的cmv?enhancer的上游以及sv40?poly(a)signal下游插入端粒酶teln的特異性識(shí)別位點(diǎn)telrl，得到質(zhì)粒pvax1-telrl-g-cpg。

13、較佳地，所述的步驟(2)具體為：利用限制性內(nèi)切酶bamhi酶切或kod?one?dna聚合酶進(jìn)行pcr線性化擴(kuò)增，獲得線性化pvax1-telrl-g-cpg片段；

14、所述的步驟(3)具體為：經(jīng)過(guò)端粒酶teln酶切孵育，獲得僅含表達(dá)g蛋白的抗原表達(dá)單元必須元件的線性閉合末端dna，命名為：dbdna-g-cpg，以及兩條冗余線性開(kāi)環(huán)片段；

15、所述的步驟(4)具體為：經(jīng)過(guò)t5核酸外切酶特異性消化線性開(kāi)環(huán)片段，只保留dbdna-g-cpg，經(jīng)過(guò)醇沉回收步驟，得到純凈的dbdna-g-cpg。

16、本發(fā)明的第三方面提供了所述的線性共價(jià)閉合dna疫苗或所述的制備方法獲得的線性共價(jià)閉合dna疫苗在傳染性造血器官壞死病防治中的應(yīng)用，特別是虹鱒傳染性造血器官壞死病的防治。

17、本發(fā)明通過(guò)ihnv病毒的截短g蛋白序列構(gòu)建出dna疫苗質(zhì)粒，并對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行了質(zhì)粒骨架的優(yōu)化改造，使其僅僅包含了抗原表達(dá)的必須元件，不含其他任何細(xì)菌冗余序列，大大降低了潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)；經(jīng)優(yōu)化得到的dbdna-g-cpg能在虹鱒細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)g蛋白抗原，引發(fā)免疫反應(yīng)，獲得保護(hù)效果。