本發(fā)明涉及使用殺有害生物蛋白和編碼它們的核酸分子來控制或?qū)挂苟昕?noctuidae)、草螟科(crambidae)和螟蛾科(pyralidae)有害生物的組合物和方法。

背景技術(shù)：

1、蘇云金芽孢桿菌(bacillus?thuringiensis，bt)是一種革蘭氏陽性的孢子形成的土壤細菌，其特征在于它產(chǎn)生晶體包含體的能力，這些晶體包含體對于某些目以及種的植物有害生物(包括昆蟲)是特異性地有毒的，但是對于植物和其他非靶標(biāo)生物是無害的。出于這個原因，包括蘇云金芽孢桿菌菌株或它們的殺昆蟲蛋白的組合物可以用作環(huán)境上可接受的殺昆蟲劑以控制農(nóng)業(yè)昆蟲有害生物或多種人或動物疾病的昆蟲媒介。

2、來自蘇云金芽孢桿菌的晶體(cry)蛋白主要針對鱗翅目的、雙翅目的、以及鞘翅目的有害昆蟲具有有力的殺昆蟲活性。這些蛋白質(zhì)還已經(jīng)顯示針對以下的有害生物的活性：膜翅目(hymenoptera)、同翅目(homoptera)、毛虱目(phthiraptera)、食毛目(mallophaga)、以及壁虱目(acari)有害生物目，連同其他的無脊椎動物目，如線蟲動物門(nemathelminthes)、扁形動物門(platyhelminthes)、以及肉足鞭毛亞門(sarcomastigorphora)(feitelson，j.1993.the?bacillus?thuringiensis?familytree.in?advanced?engineered?pesticides.marcel?dekker，inc.，new?york，n.y.)。這些蛋白最初主要基于它們的殺昆蟲活性而被分類為cryi至cryvi。主要的類別是鱗翅目特異性(i)、鱗翅目和雙翅目特異性(ii)、鞘翅目特異性(iii)、雙翅目特異性(iv)、以及線蟲特異性(v)和(vi)。這些蛋白被進一步分為亞家族；在各個家族內(nèi)更高度相關(guān)的蛋白指定了區(qū)分的字母，例如cryia、cryib、cryic等。在各個區(qū)分內(nèi)的甚至更緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)被給定名稱，例如cryic(a)、cryic(b)等。術(shù)語“cry毒素”以及“δ-內(nèi)毒素”與術(shù)語“cry蛋白”已可互換地使用。對于cry蛋白和基因的當(dāng)前新命名法基于氨基酸序列同源性而不是昆蟲靶標(biāo)特異性(crickmore等人，(1998)microbiol.mol.biol.rev.62:807-813)。在這個更可接受的分類中，每種毒素被指定唯一的名稱，該名稱合并了初級等級(阿拉伯?dāng)?shù)字)、二級等級(大寫字母)、三級等級(小寫字母)、以及四級等級(另一個阿拉伯?dāng)?shù)字)。在當(dāng)前分類中，在初級等級中羅馬數(shù)字已經(jīng)換為阿拉伯?dāng)?shù)字。例如，在舊命名法下的“cryia(a)”現(xiàn)在在當(dāng)前命名法下是“cry1aa”。根據(jù)ibrahim等人(2010，bioeng.bugs，1:31-50)，cry毒素仍然可以根據(jù)其昆蟲宿主特異性被分為六個主要類別并且包括：組1-鱗翅目(例如cry1、cry9和cry15)；組2-鱗翅目和雙翅目(例如cry2)；組3-鞘翅目(cry3、cry7和cry8)；組4-雙翅目(cry4、cry10、cry11、cry16、cry17、cry19和cry20)；組5-鱗翅目和鞘翅目(cry1i)；以及組6-線蟲(cry6)。cry1i、cry2、cry3、cry10和cry11毒素(73-82kda)是獨特的，因為它們似乎是更大cry1和cry4蛋白(130-140kda)的天然截短。

3、cry蛋白是在bt的孢子形成階段期間以晶體形式積聚為原毒素的球狀蛋白質(zhì)分子。在由有害生物攝取后，這些晶體典型地被溶解以釋放原毒素，原毒素大小的范圍可以為，例如，對于許多具有鱗翅目活性的cry蛋白如cry1和cry9為從130-140kda，并且對于具有鞘翅目活性的cry3蛋白及具有鱗翅目/雙翅目活性的cry2蛋白為60-80kda。在這些晶體被易感昆蟲溶解后，這些釋放的原毒素被昆蟲腸道中的蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶加工，以產(chǎn)生抗蛋白酶的核心cry蛋白毒素。這種蛋白水解加工涉及從各種cry原毒素的不同區(qū)域去除氨基酸。例如，為130-140kda的cry原毒素典型地通過蛋白水解去除25-30個氨基酸的n-末端肽以及c-末端的大約一半的剩余蛋白來激活，產(chǎn)生大約60-70kda成熟cry毒素。為60-80kda的原毒素(例如cry2和cry3)也被加工但是其程度不與更大的原毒素相同。與更大的原毒素相比，較小的原毒素典型地從n-末端去除相等或更多個氨基酸，但較少氨基酸被從c-末端去除。例如，cry2家族成員的蛋白水解激活典型地涉及去除大約40-50個n-末端氨基酸。許多cry蛋白對具體的靶標(biāo)昆蟲是相當(dāng)有毒的，但許多具有窄的活性譜。

4、cry蛋白通常具有五個保守序列結(jié)構(gòu)域、以及三個保守結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域(參見例如，de?maagd等人，(2001)trends?genetics，17:193-199)。第一保守結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域(稱作結(jié)構(gòu)域i)典型地由七個α螺旋組成并且參與膜插入以及孔形成。結(jié)構(gòu)域ii典型地由三個布置為希臘鑰匙構(gòu)型的β片層組成，并且結(jié)構(gòu)域iii典型地由兩個處于“果凍卷”(‘jelly-roll’)構(gòu)造的反平行的β片層組成(de?maagd等人，2001，同上)。結(jié)構(gòu)域ii和iii參與受體識別和結(jié)合，并且因此被認(rèn)為是毒素特異性的決定物。

5、眾多商業(yè)上有價值的植物(包括普通的農(nóng)作物)易受植物有害生物(包括昆蟲和線蟲有害生物)的攻擊的影響，導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)的實質(zhì)性降低。例如，植物有害生物是在全世界重要農(nóng)作物損失中的主要因素。由于病蟲害，在中國每年可收獲的谷類損失約15％-20％。此外，由于無脊椎有害生物(包含昆蟲)的侵染，僅在美國每年就損失約80億美元。昆蟲有害生物對于菜農(nóng)和果農(nóng)，對于觀賞性花卉的生產(chǎn)商，以及對于家庭花匠也是負擔(dān)。

6、昆蟲有害生物主要是通過密集使用化學(xué)殺有害生物劑來控制，這些化學(xué)殺有害生物劑通過抑制昆蟲生長、阻止昆蟲攝食或繁殖、或者導(dǎo)致死亡而有效。生物性有害生物控制劑，如表達殺有害生物毒素(如cry蛋白)的蘇云金芽孢桿菌菌株，也已經(jīng)施用于作物植物中，產(chǎn)生了令人滿意的結(jié)果，提供化學(xué)殺有害生物劑的替代物或補充物。已經(jīng)分離了編碼這些cry蛋白的一些的基因并且它們在異源宿主(如轉(zhuǎn)基因植物)中的表達已經(jīng)顯示出提供了另一種用于控制經(jīng)濟上重要的昆蟲有害生物的手段。大多數(shù)cry蛋白對非常有限的昆蟲有害生物譜具有活性。并且典型地，針對一種昆蟲物種的活性并不能預(yù)測針對不同昆蟲物種的活性。

7、鱗翅目有害生物(包括本公開內(nèi)容的夜蛾科(noctuid)、草螟科(crambid)和螟蛾科(pyralid)有害生物)在中國和存在此類有害生物的其他國家仍然是一個問題。此外，對現(xiàn)有殺昆蟲蛋白產(chǎn)生抗性的威脅意味著引入新的殺昆蟲蛋白很重要。因此，仍然需要鑒定能夠控制鱗翅目有害生物(例如，本公開內(nèi)容的夜蛾科、草螟科和螟蛾科有害生物)的殺昆蟲蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本公開內(nèi)容提供了控制鱗翅目有害生物(例如，夜蛾科、草螟科和螟蛾科有害生物)以及保護作物(特別是玉米和水稻)免受此類有害生物造成的經(jīng)濟損害的組合物和方法。本公開內(nèi)容進一步涉及用編碼單獨的或與其他殺昆蟲蛋白組合的本公開內(nèi)容的cry蛋白的核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物(尤其是單子葉植物，特別是玉米(玉蜀黍(maize，zeamays))和水稻(稻(oryza?sativa)))用于控制或?qū)棍[翅目(例如，夜蛾科、草螟科和螟蛾科)的用途。本公開內(nèi)容還進一步涉及含有本公開內(nèi)容的cry蛋白的殺昆蟲配制品保護植物免受鱗翅目(例如，夜蛾科、草螟科和螟蛾科)的影響的用途。本公開內(nèi)容還涉及植物，尤其是單子葉植物，特別是玉米或水稻植物，該植物可被鱗翅目(例如，夜蛾科、草螟科和螟蛾科)侵染并且用編碼本公開內(nèi)容的cry蛋白的可表達的核酸分子轉(zhuǎn)化以對抗或控制鱗翅目例如夜蛾科、草螟科和螟蛾科有害生物種群。

2、根據(jù)本公開內(nèi)容，提供了通過以下步驟來對抗和/或控制鱗翅目例如夜蛾科、草螟科和螟蛾科昆蟲物種的方法：將這些昆蟲與包含seq?id?no:1的氨基酸序列的cry蛋白或其殺昆蟲片段接觸，這些物種為：黏蟲(mythimna?separata)(東方黏蟲(orientalarmyworm))、二點委夜蛾(athetis?lepigone)(二斑黏蟲(two-spotted?armyworm))、斜紋夜蛾(spodoptera?litura)(夜盜蟲(common?cutworm)/蓮紋夜蛾(oriental?leafworm))、小地老虎(agrotis?ipsilon)(黑土蠶(black?cutworm))、桃蛀螟(conogethespunctiferalis)(桃蛀野螟(yellow?peach?moth))、二化螟(chilosuppressalis)(條紋莖螟(striped?stem?borer))、大螟(sesamia?inferens)(粉蛀莖螟(pink?stem?borer))或玉米螟(ostrinia?furnacalis)(亞洲玉米螟(asian?corn?borer))。在一些實施方案中，小地老虎(黑土蠶)來自中國的小地老虎(黑土蠶)種群。在一些實施方案中，夜蛾科、草螟科和螟蛾科昆蟲是桃蛀螟(桃蛀野螟)、二化螟(條紋莖螟)、大螟(粉蛀莖螟)或玉米螟(亞洲玉米螟)。

3、在一些實施方案中，接觸步驟可以利用殺昆蟲組合物進行，該殺昆蟲組合物包含：本公開內(nèi)容的cry蛋白或其殺昆蟲片段、以及可接受的農(nóng)業(yè)載體。在一些實施方案中，昆蟲的接觸可以是與植物接觸，尤其是單子葉植物，特別是玉米或水稻植物，該植物用編碼本公開內(nèi)容的cry蛋白的可表達的核酸分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，使得經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物以有效的昆蟲控制量表達本公開內(nèi)容的cry蛋白或其殺昆蟲片段。

4、此外，通過將被鱗翅目(例如夜蛾科、草螟科和螟蛾科昆蟲)侵染的植物(尤其是單子葉植物，特別是玉米或水稻植物)用編碼本公開內(nèi)容的cry蛋白的基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，來保護其免受這種昆蟲帶來的持續(xù)經(jīng)濟損害。

5、對序列表中的序列的簡述

6、seq?id?no:1是ecry1ba-t2ay150kl189s蛋白的氨基酸序列。