本申請涉及一種恒定自然殺傷t細胞擴增方法，特別涉及一種由周邊血干細胞樣本中提高恒定自然殺傷t細胞的數(shù)量及純度的擴增方法。

背景技術(shù)：

1、免疫細胞治療在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中亟具發(fā)展?jié)摿?，其是以患者自身的免疫系統(tǒng)為基礎(chǔ)，透過啟動或強化免疫反應(yīng)，達到對抗癌癥及其他相關(guān)疾病的功效。著名的免疫細胞治療如：car-t細胞療法，所述療法透過改造患者的t細胞，賦予它們對特定腫瘤抗原的靈敏性，以針對性地攻擊癌細胞，從而達到直接抑制癌細胞的效果。

2、恒定自然殺傷t(invariant?natural?killer?t，inkt)細胞，同時具有t細胞和自然殺手(natural?killer，nk)細胞的特性，可以藉由辨識細胞表面的醣脂質(zhì)抗原cd1d，活化并引發(fā)下游的免疫反應(yīng)，達到直接抑癌及協(xié)助其他免疫細胞共同抑癌的效果，除了癌癥抑制，恒定自然殺傷t細胞同時具有免疫調(diào)節(jié)的能力，透過清除發(fā)炎的細胞，降低身體的發(fā)炎反應(yīng)，其對于治療慢性發(fā)炎相關(guān)的病癥亦有一定程度的療效。

3、恒定自然殺傷t細胞主要由人體的周邊血中取得，由于周邊血不需麻醉即可采集，在臨床應(yīng)用上相對便利及安全，然而，恒定自然殺傷t細胞在一般成人的周邊血中僅占0.01％-0.5％，數(shù)量相當(dāng)稀少，且難以純化及放大，以至于現(xiàn)階段的應(yīng)用相當(dāng)受限。因此，如何有效擴增并得到高純度的恒定自然殺傷t細胞是本領(lǐng)域亟待解決的重要議題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于前述內(nèi)容，本申請?zhí)峁┮环N恒定自然殺傷t細胞擴增方法，其特征在于，所述方法包含：

2、提供一周邊血干細胞(peripheral?blood?stem?cells，pbscs)樣本；

3、將所述周邊血干細胞樣本以一擴增培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所述擴增培養(yǎng)基包含白細胞介素2(interleukin?2，il-2)、白細胞介素15(il-15)及α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-galactosylceramide)；以及調(diào)整培養(yǎng)后的細胞的細胞數(shù)目，并與飼養(yǎng)細胞進行共培養(yǎng)，所述飼養(yǎng)細胞是為一樹突細胞(dendritic?cell,dc)及一周邊血單核細胞(peripheralblood?mononuclear?cells，pbmcs)。

4、于某些具體實施例中，所述周邊血干細胞樣本是采集自以白血球生長激素(granulocyte?colony?stimulating?factor，g-csf)處理5天的周邊血，其中所述周邊血經(jīng)由血液血球分離機進行分離。

5、于某些具體實施例中，所述樹突細胞是以添加顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte-macrophage?colony-stimulating?factor，gm-csf)及白細胞介素4(il-4)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)使單核球分化而得，再以添加脂多醣(lipopolysaccharide，lps)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)使所述樹突細胞成熟。

6、于某些具體實施例中，所述周邊血單核細胞于共培養(yǎng)前，以絲裂霉素c(mitomycin-c，mmc)作用3小時。

7、于某些具體實施例中，所述共培養(yǎng)是調(diào)整所述培養(yǎng)后的細胞與所述飼養(yǎng)細胞的細胞數(shù)目比例為1：2，其中所述飼養(yǎng)細胞的所述樹突細胞及所述周邊血單核細胞的細胞數(shù)目比例為1：1。

8、于某些具體實施例中，所述擴增方法的步驟包含：

9、將所述周邊血干細胞樣本以所述擴增培養(yǎng)基進行培養(yǎng)7天；

10、調(diào)整培養(yǎng)后的細胞的細胞數(shù)目，并與飼養(yǎng)細胞的所述樹突細胞及所述周邊血單核細胞以1：1：1的細胞數(shù)目比例透過所述擴增培養(yǎng)基進行共培養(yǎng)7天；以及

11、調(diào)整共培養(yǎng)后的細胞的細胞數(shù)目，再與飼養(yǎng)細胞的所述樹突細胞及所述周邊血單核細胞以1：1：1的細胞數(shù)目比例透過所述擴增培養(yǎng)基進行共培養(yǎng)7天。

12、于某些具體實施例中，其中在擴增完成后進一步使用磁珠分離系統(tǒng)分選所述恒定自然殺傷t細胞。

13、于一方面，本申請?zhí)峁┮环N恒定自然殺傷t細胞，其是以如前所述的擴增方法培養(yǎng)取得。

14、于另一方面，本申請?zhí)峁┮环N如前所述的恒定自然殺傷t細胞的用途，其是用于制備抗腫瘤的醫(yī)藥組合物。

15、于又一方面，本申請?zhí)峁┮环N如前所述的恒定自然殺傷t細胞的用途，其是用于制備抑制癌細胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組合物。

16、本申請所提供的恒定自然殺傷t細胞擴增方法，采集自白血球生長激素處理所得的周邊血干細胞樣本，透過本申請所述擴增培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，再結(jié)合樹突細胞及周邊血單核細胞作為飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)，能達到有效擴增恒定自然殺傷t細胞的數(shù)量，大幅提高恒定自然殺傷t細胞的純度，且經(jīng)實驗證實本申請所培養(yǎng)的恒定自然殺傷t細胞具有抗腫瘤及抑制癌細胞轉(zhuǎn)移等功效。

17、藉由本申請的擴增技術(shù)可取得足量供病患移植的恒定自然殺傷t細胞，且周邊血的采集相對容易，有助于臨床應(yīng)用上的便利性及安全性，加上細胞凍存的技術(shù)，擴增后的恒定自然殺傷t細胞可被適當(dāng)?shù)乇４妫⒃谛枰委煹臅r間點及時進行回注，對于未來免疫細胞治療的發(fā)展具有極高的潛力。

技術(shù)特征：

1.一種恒定自然殺傷t細胞擴增方法，其特征在于，所述方法包含：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒定自然殺傷t細胞擴增方法，其特征在于，所述周邊血干細胞樣本是采集自以白血球生長激素(granulocyte?colony?stimulating?factor，g-csf)處理5天的周邊血，其中所述周邊血經(jīng)由血液血球分離機進行分離。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒定自然殺傷t細胞擴增方法，其特征在于，所述樹突細胞是以添加顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte-macrophage?colony-stimulatingfactor，gm-csf)及白細胞介素4(il-4)的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)使單核球分化而得，再以添加脂多醣的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)使所述樹突細胞成熟。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒定自然殺傷t細胞擴增方法，其特征在于，所述周邊血單核細胞于共培養(yǎng)前，以絲裂霉素c(mitomycin-c，mmc)作用3小時。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒定自然殺傷t細胞擴增方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)是調(diào)整所述培養(yǎng)后的細胞與所述飼養(yǎng)細胞的細胞數(shù)目比例為1：2，其中所述飼養(yǎng)細胞的所述樹突細胞及所述周邊血單核細胞的細胞數(shù)目比例為1：1。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒定自然殺傷t細胞擴增方法，其特征在于，所述擴增方法的步驟包含：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恒定自然殺傷t細胞擴增方法，其特征在于，在擴增完成后進一步使用磁珠分離系統(tǒng)分選所述恒定自然殺傷t細胞。

8.一種恒定自然殺傷t細胞，其特征在于，所述恒定自然殺傷t細胞是根據(jù)權(quán)利要求1至7中任意一項所述的擴增方法培養(yǎng)取得。

9.一種根據(jù)權(quán)利要求8所述的恒定自然殺傷t細胞的用途，其是用于制備抗腫瘤的醫(yī)藥組合物。

10.一種根據(jù)權(quán)利要求8所述的恒定自然殺傷t細胞的用途，其是用于制備抑制癌細胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組合物。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明關(guān)于一種恒定自然殺傷T細胞(invariant?natural?killer?T,iNKT)族群擴增方法及其應(yīng)用，其包含：提供一周邊血干細胞樣本；將所述周邊血干細胞樣本以一擴增培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所述擴增培養(yǎng)基包含白細胞介素2、白細胞介素15及α?半乳糖神經(jīng)酰胺；以及調(diào)整培養(yǎng)后的細胞的細胞數(shù)目，并與飼養(yǎng)細胞以所述擴增培養(yǎng)基進行共培養(yǎng)，所述飼養(yǎng)細胞是為一樹突細胞及一周邊血單核細胞。

技術(shù)研發(fā)人員：沈耀安,涂啟堂,陳炯瑜,莊雅清
受保護的技術(shù)使用者：長春藤生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15