本發(fā)明屬于生物，具體涉及bc17蛋白在調(diào)控植物莖稈糖化效率中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、能源短缺是世界各國所面臨的重要難題。提高可再生物質(zhì)的能源轉(zhuǎn)化效率是解決能源問題的重要途徑。生物質(zhì)是世界上最豐富、最價(jià)廉又可再生的自然資源，僅農(nóng)作物生產(chǎn)中的農(nóng)副產(chǎn)品秸稈的數(shù)量就頗為巨大。

2、秸稈的能源轉(zhuǎn)化是人類有效利用秸稈的重要方面，也是產(chǎn)生可再生能源的重要途徑。秸稈的本質(zhì)是細(xì)胞壁，主要由纖維素、半纖維素、果膠和木質(zhì)素等多聚物交聯(lián)形成。主要多糖如纖維素和半纖維素等轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)酵單糖(即糖化過程)是產(chǎn)生生物能源的重要步驟，而多糖的結(jié)構(gòu)和交聯(lián)方式是決定這一反應(yīng)速度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，針對細(xì)胞壁多糖的遺傳改良是從源頭上提高糖化效率、解決生物能源可降解性和產(chǎn)業(yè)化的重要途徑。

3、水稻、玉米和小麥等禾本科植物細(xì)胞壁半纖維素主要是木聚糖，其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，處于交聯(lián)纖維素和木質(zhì)素的核心位置，在決定細(xì)胞壁高級結(jié)構(gòu)中起著重要作用。而且木糖是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的可發(fā)酵糖。因此，木聚糖對木質(zhì)纖維素整體糖化效率和能源轉(zhuǎn)化效率有重要影響。

4、乙?；揎検悄揪厶巧陷^為普遍的修飾形式，對木聚糖的構(gòu)象和多糖交聯(lián)起重要調(diào)控作用，是細(xì)胞壁功能改造的重要切入點(diǎn)。發(fā)掘調(diào)控植物生長發(fā)育和秸稈糖化效率的木聚糖乙?；P(guān)鍵調(diào)控蛋白，通過遺傳改良木聚糖，將為優(yōu)化秸稈降解和實(shí)現(xiàn)能源轉(zhuǎn)化產(chǎn)業(yè)化提供新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何提高植物莖稈糖化效率。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了bc17蛋白質(zhì)或其相關(guān)生物材料的新用途。

3、本發(fā)明提供了bc17蛋白質(zhì)或其相關(guān)生物材料在如下1)-5)任一種中的應(yīng)用：

4、1)調(diào)控木聚糖乙酰化水平；

5、2)調(diào)控植物細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)；

6、3)調(diào)控植物細(xì)胞壁糖化效率；

7、4)培育木聚糖乙酰化水平提高和/或細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)改變和/或細(xì)胞壁糖化效率降低的轉(zhuǎn)基因植物；

8、5)植物育種；

9、所述bc17蛋白質(zhì)為如下(a1)-(a4)任一所述的蛋白質(zhì)：

10、(a1)序列2所示的蛋白質(zhì)；

11、(a2)在(a1)所述蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白；

12、(a3)將(a1)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與木聚糖乙?；胶?或細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)和/或細(xì)胞壁糖化效率相關(guān)的蛋白質(zhì)；

13、(a4)與(a1)具有98％以上同一性且與木聚糖乙?；胶?或細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)和/或細(xì)胞壁糖化效率相關(guān)的蛋白質(zhì)。

14、上述(a2)所述蛋白質(zhì)中，所述標(biāo)簽是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白質(zhì)，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測、示蹤和/或純化。所述標(biāo)簽包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白、6his標(biāo)簽蛋白、mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、egfp(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)、ecfp(增強(qiáng)型青色熒光蛋白)、eyfp(增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白)、mcherry(單體紅色熒光蛋白)或avitag標(biāo)簽蛋白。

15、上述(a3)所述蛋白質(zhì)中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過9個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過8個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過7個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過6個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過5個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過4個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過3個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過2個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過1個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

16、上述(a4)所述蛋白質(zhì)中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性?？墒褂脟H互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)測定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambdaratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進(jìn)行檢索一對氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值(％)。

17、上述應(yīng)用中，所述相關(guān)生物材料為編碼所述bc17蛋白質(zhì)的核酸分子或含有所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體或重組微生物。

18、上述編碼所述bc17蛋白質(zhì)的核酸分子可為如下(a1)或(a2)任一所述的dna分子：

19、(a1)序列1或序列3所示的dna分子；

20、(a2)與(a1)具有75％以上同一性且編碼所述bc17蛋白質(zhì)的dna分子。

21、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼bc17蛋白質(zhì)的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的bc17核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼bc17蛋白質(zhì)且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

22、這里使用的術(shù)語“同一性”是指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

23、所述表達(dá)盒是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)bc17蛋白質(zhì)的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)bc17轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止bc17轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步的，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。

24、所述載體可為質(zhì)粒、噬菌體、黏粒、ti質(zhì)?；虿《据d體。

25、在實(shí)際應(yīng)用中，可采用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有bc17基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括但不限于雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。

26、使用bc17基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，包括但不限于如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。

27、為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入包括但不限于可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除草劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

28、利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的bc17基因或基因的片段導(dǎo)入植物細(xì)胞或受體植物，可獲得糖化效率改變的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶bc17基因的表達(dá)載體可通過使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。

29、所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌；所述細(xì)菌可為農(nóng)桿菌(如農(nóng)桿菌eha105)。

30、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控木聚糖乙?；綖樘岣吣揪厶且阴；?。

31、所述調(diào)控植物細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)為調(diào)控植物細(xì)胞壁納米纖絲排布。

32、所述調(diào)控植物細(xì)胞壁糖化效率為降低植物細(xì)胞壁糖化效率。

33、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了抑制上述bc17蛋白質(zhì)的物質(zhì)的新用途。

34、本發(fā)明提供了抑制上述bc17蛋白質(zhì)的物質(zhì)在如下(d1)-(d5)任一種中的應(yīng)用：

35、(d1)降低木聚糖乙酰化水平；

36、(d2)調(diào)控植物細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)；

37、(d3)提高植物細(xì)胞壁糖化效率；

38、(d4)培育木聚糖乙?；浇档秃?或細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)改變和/或細(xì)胞壁糖化效率提高的轉(zhuǎn)基因植物；

39、(d5)植物育種。

40、進(jìn)一步的，所述抑制上述bc17蛋白質(zhì)的物質(zhì)可為抑制上述bc17蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)或抑制編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因表達(dá)的物質(zhì)或敲除編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因的物質(zhì)。

41、所述抑制上述bc17蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)可為任何能夠使植物中上述bc17蛋白質(zhì)活性缺失的物質(zhì)，如抑制上述bc17蛋白質(zhì)合成或促進(jìn)上述bc17蛋白質(zhì)降解或抑制上述bc17蛋白質(zhì)功能的蛋白質(zhì)、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制劑)。

42、所述抑制編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因表達(dá)的物質(zhì)可為任何能夠使植物中編碼上述bc17蛋白質(zhì)的基因無法表達(dá)的物質(zhì)，如沉默植物中編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因的物質(zhì)(如mirna、sirna、dsrna、shrna等)。

43、所述敲除編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因的物質(zhì)可為以任何方式實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞不產(chǎn)生bc17基因的功能性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的物質(zhì)，具體方式如去除全部或部分編碼基因序列、引入移碼突變使得不產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)、去除或改變調(diào)節(jié)組分(例如啟動(dòng)子編輯)使得編碼基因序列不被轉(zhuǎn)錄、通過與mrna的結(jié)合阻止翻譯等。通常，敲除在基因組dna水平上進(jìn)行，使得細(xì)胞的后代也永久地?cái)y帶敲除。再進(jìn)一步的，所述敲除編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因的物質(zhì)可為任何能夠使植物中編碼上述bc17蛋白質(zhì)的基因發(fā)生突變(所述突變形式可為缺失突變和/或插入突變和/或堿基替換)從而失去活性的物質(zhì)，如鋅指蛋白zfn基因編輯系統(tǒng)或talens基因編輯系統(tǒng)或crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)等。

44、更進(jìn)一步的，所述敲除編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因的物質(zhì)為crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)。

45、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)或所述植物細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)改變可為使植物細(xì)胞壁納米纖絲排布疏松和/或紊亂。

46、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育木聚糖乙?；教岣吆?或細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)改變和/或細(xì)胞壁糖化效率降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

47、本發(fā)明提供的培育木聚糖乙?；教岣吆?或細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)改變和/或細(xì)胞壁糖化效率降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括提高受體植物中上述bc17蛋白質(zhì)的活性和/或含量，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟。

48、進(jìn)一步的，所述提高受體植物中上述bc17蛋白質(zhì)的活性和/或含量的方法為在受體植物中過表達(dá)上述bc17蛋白質(zhì)。

49、所述過表達(dá)的方法可為將上述bc17蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w植物中。

50、更進(jìn)一步的，所述bc17蛋白質(zhì)的編碼基因可為序列1或序列3所示的dna分子。

51、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后提供了一種培育木聚糖乙酰化水平降低和/或細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)改變和/或細(xì)胞壁糖化效率提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

52、本發(fā)明提供的培育木聚糖乙?；浇档秃?或細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)改變和/或細(xì)胞壁糖化效率提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法為如下方法一或方法二：

53、所述方法一包括降低受體植物中上述bc17蛋白質(zhì)的活性和/或含量，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟。

54、所述方法二包括將受體植物中的bc17基因(序列3)替換為序列4或序列5所示的dna分子，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟。

55、進(jìn)一步的，所述方法一中，所述降低受體植物中上述bc17蛋白質(zhì)的活性和/或含量的方法為將敲除編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因的物質(zhì)導(dǎo)入受體植物。

56、更進(jìn)一步的，所述敲除編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因的物質(zhì)為crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)。

57、所述crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)包括cas9核酸酶和靶向bc17基因的sgrna；所述sgrna的靶序列為acggcgatggcggccgccgccgg。

58、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述敲除編碼上述bc17蛋白質(zhì)基因的物質(zhì)為重組載體pylcrispr/cas9-mh-bc17。

59、所述方法二中，所述替換為純合型替換，即同源染色體中發(fā)生相同的替換。

60、上述任一所述應(yīng)用或方法中，所述細(xì)胞壁糖化效率可為莖稈或秸稈糖化效率。

61、上述任一所述應(yīng)用或方法中，所述植物為下述任一種植物：

62、n1)單子葉植物或雙子葉植物；

63、n2)禾本目植物；

64、n3)禾本科植物；

65、n4)稻屬植物；

66、n5)水稻(如日本晴)。

67、本發(fā)明通過構(gòu)建bc17突變體并對其木聚糖乙?；揎椝竭M(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：與野生型水稻日本晴相比，bc17突變體木聚糖中乙?；揎椝斤@著降低，證明了bc17蛋白可調(diào)控木聚糖乙?；揎椝健＿M(jìn)一步對其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與糖化效率進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，bc17突變體纖維細(xì)胞的細(xì)胞壁的納米纖絲排布疏松、紊亂，細(xì)胞壁糖化效率顯著增加，說明bc17蛋白可調(diào)控細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)以及莖稈糖化效率。以上結(jié)果表明：bc17蛋白可通過調(diào)控木聚糖乙酰化修飾水平，進(jìn)而調(diào)控植物細(xì)胞壁功能結(jié)構(gòu)和糖化效率，本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)秸稈高效能源轉(zhuǎn)化提供了基因資源和有效途徑。