本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)。具體涉及一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細胞外囊泡(extracellular?vesicle，ev)是由細胞釋放的各種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡統(tǒng)稱。由于其直徑和發(fā)生方式的不同，分為外泌體(exosomes，直徑30～150nm)、微泡(microvesicles，直徑100～1000nm)、凋亡小體(apoptotic?body，直徑100～5000nm)、癌小體(oncosomes，直徑1～10μm)等。細胞外囊泡具有納米級脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹多種蛋白、核酸和代謝物，調(diào)控靶細胞的生物學(xué)功能以實現(xiàn)細胞間通訊。

2、細胞外囊泡具有屏障穿透能力、生物相容性好、免疫原性低等眾多特性。這使其成為理想的藥物遞送載體。通過工程化改造細胞的方式獲得其所分泌的工程化細胞外囊泡更是具有組織器官靶向性等優(yōu)勢。

3、癌胚硫酸軟骨素ofcs(oncofetal?chondroitin?sulfate，ofcs)由丹麥哥本哈根大學(xué)ali?salanti課題組于2015年在cancer?cell雜志上報道，發(fā)現(xiàn)人類大多數(shù)癌細胞和胎盤滋養(yǎng)層細胞中存在一類共同的糖胺聚糖分子。此外，通過對瘧疾的研究得知瘧原蟲來源蛋白var2csa結(jié)合ofcs，而var2csa中存在幾段ofcs的最短結(jié)合多肽(ofcs-bindingpeptides，ofcsbps)。重組var2csa蛋白或合成ofcs-bps可被用來作為探針實現(xiàn)對胎盤源性疾病和癌癥的診斷和治療。

4、中國授權(quán)號為cn109589416b、cn109568289b和cn109589413b的發(fā)明專利公開了基于ofcs-bps靶向ofcs的納米顆粒載體的制備方法和應(yīng)用。然而，人工合成的ofcs-bps與納米顆粒的組裝步驟繁瑣，成本高，且所獲得的納米顆粒載體本身會具有一定的毒性。為克服和優(yōu)化這些缺陷，我們構(gòu)建了一種ofcs靶向工程化細胞外囊泡的制備方法，通過基因工程的方法在hek293f細胞中過表達ofcsbps-lamp2b-egfp融合蛋白并收集其分泌的細胞外囊泡。該工程化細胞外囊泡成功的在胎盤滋養(yǎng)層細胞中靶向富集。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在缺陷，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種靶向ofcs陽性細胞的工程化細胞外囊泡的制備方法。本發(fā)明利用慢病毒載體系統(tǒng)在hek293f細胞中穩(wěn)定過表達ofcsbps-lamp2b-egfp，收集細胞上清液，超速離心獲得細胞外囊泡，該工程化細胞外囊泡具有ofcs陽性細胞靶向性(如胎盤滋養(yǎng)層細胞、腫瘤/癌細胞等)的特性。由于細胞外囊泡具有納米級脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，可將臨床已應(yīng)用或正在臨床前研究中的診療相關(guān)分子投遞到靶部位。本發(fā)明適用于人類及動物胎盤源性生理/病理和腫瘤/癌癥等多種疾病的基礎(chǔ)研究和臨床診療應(yīng)用。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡，所述工程化細胞外囊泡是通過收集穩(wěn)定過表達含有ofcsbps的融合蛋白質(zhì)粒載體的細胞上清液分離所獲的；

4、其中，ofcsbps的序列選自seq?id?no.1-7中的一條或多條的組合多肽序列，或以seq?id?no.1-7中的一條多肽序列作為骨架的衍生序列或多條組合多肽序列作為骨架的衍生序列。序列seq?id?no.1-7均屬于var2csa中存在幾段ofcs的最短結(jié)合多肽。

5、所述的一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡，所述含有ofcsbps的融合蛋白質(zhì)粒載體中包含用于細胞外囊泡表面表達定位的蛋白；

6、優(yōu)選，所述用于細胞外囊泡表面表達定位的蛋白選自lamp2b、cd9、cd63、cd47、cd81、apmap、tspan14、tsg101、alix、flotillin-1、syntenin-1、hsp70中的一種。

7、所述的一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡，所述含有ofcsbps的融合蛋白質(zhì)粒載體中包含用于細胞轉(zhuǎn)染效率檢測、篩選、純化以及示蹤的蛋白；

8、優(yōu)選，所述用于細胞轉(zhuǎn)染效率檢測、篩選、純化以及示蹤的蛋白選自egfp、gfp、eyfp、mrfp1、mcherry、luciferase、6*his、flag、gst、c-myc中的一種。

9、所述的一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡，所述細胞選自細胞系、原代細胞、類器官細胞、單細胞、動植物活體細胞中的一種；

10、優(yōu)選，所述細胞系為hek293f細胞。

11、所述的一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡，所述轉(zhuǎn)染的方式為慢病毒侵染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法或電轉(zhuǎn)法中的一種。

12、所述的一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡，所述細胞外囊泡的尺寸為30-200nm，所述細胞外囊泡的形狀為茶托樣或一側(cè)凹陷半球狀形貌，所述細胞外囊泡的表面含有ofcsbps或ofcsbps的擬肽物。

13、第二方面，本發(fā)明提供了任一項所述的一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡的制備方法，包括以下步驟：

14、s1、構(gòu)建含有ofcsbps的融合蛋白質(zhì)粒載體；

15、s2、將步驟s1所得質(zhì)粒載體通過慢病毒侵染入細胞中，篩選獲得用于細胞轉(zhuǎn)染效率檢測、篩選、純化以及示蹤的蛋白陽性細胞單克隆細胞株；

16、s3、收集步驟s2所得的細胞上清液，通過分離獲得工程化細胞外囊泡。

17、所述的制備方法，其特征在于，所述篩選的方法為流式細胞分選或有限稀釋法中的一種；所述分離的方法選自超速離心、密度梯度離心、尺寸排阻色譜、超濾、切向流過濾或免疫親和捕獲中的一種。

18、任一項所述的一種靶向癌胚硫酸軟骨素陽性細胞工程化細胞外囊泡在制備研究、診斷、治療或預(yù)防腫瘤、胎盤源性生理或病理疾病、子宮源性生理或病理疾病的藥物或制劑中的應(yīng)用。

19、所述的應(yīng)用，所述工程化細胞外囊泡作為遞送載體裝載用于研究、檢測、預(yù)防或治療腫瘤、胎盤源性生理或病理疾病、子宮源性生理或病理疾病的成分；

20、優(yōu)選，所述成分選自多肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、rna、dna或小分子化合物中的一種；

21、優(yōu)選，所述胎盤源性生理或病理疾病為早期流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、異位妊娠、胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)生長受限、妊高癥、子癇前期、早產(chǎn)、妊娠期糖尿病、胎盤植入性疾病、妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的一種；

22、優(yōu)選，所述子宮源性生理或病理疾病為子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜腺肌癥、宮腔粘連、子宮肌瘤、子宮纖維瘤中的一種；

23、優(yōu)選，所述裝載的方法為基因工程改造、化學(xué)修飾、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、共孵育、超聲、凍融循環(huán)、擠壓、表面活性劑中的一種。

24、步驟s1中所述含有ofcsbps的融合蛋白質(zhì)粒載體的具體構(gòu)建過程為：

25、(1)引物設(shè)計，pcr克隆目的片段；

26、(2)目的片段切膠回收；

27、(3)goldengate反應(yīng)構(gòu)建中間載體及測序鑒定；

28、(4)lr反應(yīng)，轉(zhuǎn)化及終載體陽性克隆鑒定。

29、步驟s3中采用超速離心方法分離獲得細胞外囊泡時，具體操作過程如下：

30、(1)收集細胞上清，4℃300g離心10min，去除細胞；

31、(2)4℃2000g離心20min，去除死細胞；

32、(3)4℃10000g離心30min，去除細胞碎片；

33、(4)0.22μm濾器過濾，去除雜質(zhì)和細菌；

34、(5)超速離心機120000g離心120min，棄上清，用pbs洗滌一遍；

35、(6)超速離心機120000g離心60min，棄上清，沉淀為細胞外囊泡，pbs重懸后bca定量，按照50μg/管分裝放置于-80℃冰箱凍存。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有以下有益效果：

37、1、本發(fā)明的步驟簡單，制備成本相對較低。

38、2、本發(fā)明方法與化學(xué)合成和組裝獲得的藥物靶向納米顆粒載體相比，通過本發(fā)明所提供方案制備的細胞外囊泡具有毒性低、免疫原性低、生物相容性強的優(yōu)點。

39、3、本發(fā)明提供的工程化細胞外囊泡對胎盤功能和腫瘤/癌癥基礎(chǔ)研究以及胎盤源性疾病和腫瘤/癌癥的臨床診療具有重大的意義。一方面，可以將藥物裝載到該工程化細胞外囊泡中，針對正常生理狀態(tài)胎盤和病理狀態(tài)下胎盤進行干預(yù)，分別達到避孕和緩解治療等目的。針對腫瘤/癌組織病灶進行靶向遞送，達到治療的目的。另一方面，可以將造影劑裝載到該工程化細胞外囊泡中，實現(xiàn)對胎盤和腫瘤/癌整影像學(xué)觀察，達到診斷的目的。