背景技術(shù)：

1、rna測序已成為轉(zhuǎn)錄組分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。與其它方法相比，其提供了轉(zhuǎn)錄本及其異構(gòu)體的水平和多樣性的精確得多的測量。當(dāng)轉(zhuǎn)錄本的末端序列未知時(shí)，或者當(dāng)測序文庫由非常有限的量的rna材料(例如來自單細(xì)胞的總rna)制備時(shí)，魯棒的全長cdna合成和銜接子添加對于從所研究的轉(zhuǎn)錄組中產(chǎn)生具有代表性的無偏差的核酸材料源至關(guān)重要。在這種情況下，已利用逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)來同時(shí)地富集全長cdna并在第一鏈合成過程中向cdna分子的5’端和3’端添加兩個不同的銜接子，這克服了基于連接的方法的許多缺點(diǎn)。利用模板轉(zhuǎn)換的單細(xì)胞應(yīng)用取決于逆轉(zhuǎn)錄和模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)的效率和特異性。由于rna輸入量極低，來自模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(template?switching?oligo)的非特異性逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸多聯(lián)化(concatemerization)主導(dǎo)測序文庫，從而限制了該方法的應(yīng)用。

2、因此，本領(lǐng)域需要改善的組合物以提高基于模板轉(zhuǎn)換的rna-seq文庫制備的特異性和產(chǎn)量。本發(fā)明解決了這一未滿足的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開的特征在于模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(template?switching?oligonucleotides，tso)和包含該模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸的組合物、及其相關(guān)使用方法。在一個實(shí)施方案中，模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(tso)包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列。在實(shí)施方案中，tso可通過與非模板化核苷酸、例如添加至目標(biāo)核酸分子的5’端的非模板化核苷酸進(jìn)行堿基配對而退火。在實(shí)施方案中，非模板化核苷酸通過逆轉(zhuǎn)錄酶添加至目標(biāo)核酸。在實(shí)施方案中，tso還包含3’端修飾和5’端修飾中的至少一者。

2、在實(shí)施方案中，tso包含3’端修飾。在實(shí)施方案中，3’端修飾可為去除3’羥基的修飾或阻斷3’羥基的修飾。在一個實(shí)施方案中，tso包含選自由以下組成的組的3’端修飾：3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯(carboxylate)、3’硫醇基(thiol)、3’o-甲基、3’疊氮基(azido)、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)和3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

3、在實(shí)施方案中，tso包含5’端修飾。在一個實(shí)施方案中，5’端用化學(xué)基團(tuán)修飾以減少或?qū)嵸|(zhì)上阻斷多聯(lián)化。在一個實(shí)施方案中，5’端用選自由以下組成的組的化學(xué)基團(tuán)修飾：三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子(spacer)、棕櫚酸亞磷酰胺(palmitate?phosphoramidite)、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基和補(bǔ)骨脂素。

4、在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少10、9、8、7、6、5、4、3或2個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)(abasic?site)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少10個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少8個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少6個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少5個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少4個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少3個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少2個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。

5、在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少一個非天然核苷酸或核苷酸類似物。在一個實(shí)施方案中，在5’端的核苷酸是非天然核苷酸或核苷酸類似物。在一個實(shí)施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

6、在一個實(shí)施方案中，tso包含至少一種3’端修飾和至少一種5’端修飾。

7、在一個實(shí)施方案中，本公開涉及一種逆轉(zhuǎn)錄(rt)引物，其包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列，其中rt引物包含5’端修飾。在一個實(shí)施方案中，5’端用化學(xué)基團(tuán)修飾以阻斷多聯(lián)化。在一個實(shí)施方案中，5’端用選自由5’trebler和5’三苯甲基組成的組的化學(xué)基團(tuán)修飾。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少3個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，在5’端的核苷酸是非天然核苷酸或核苷酸類似物。在一個實(shí)施方案中，rt引物在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

8、在一個實(shí)施方案中，本公開涉及一種從rna模板生成cdna分子的方法，所述方法包括使rna模板與包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列的tso接觸，其中tso能夠通過與在通過逆轉(zhuǎn)錄酶的非模板化添加過程中已添加至目標(biāo)核酸分子的5’端的非模板化核苷酸進(jìn)行堿基配對而退火，并且其中tso進(jìn)一步包含3’端修飾和5’端修飾中的至少一者、逆轉(zhuǎn)錄(rt)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶。

9、在一個實(shí)施方案中，rt引物包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列，其中rt引物包含5’端修飾。在一個實(shí)施方案中，5’端用三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補(bǔ)骨脂素修飾。

10、在一個實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄酶是marathonrt或其變體、莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(moloney?murine?leukemia?virus?reverse?transcriptase)(mmlv?rt)或其變體、鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(avian?myeloblastosis?virus?reversetranscriptase)(amv?rt)或其變體、hiv逆轉(zhuǎn)錄酶(hiv?rt)或其變體、家蠶(bombyx?mori)r2rna元件逆轉(zhuǎn)錄酶(r2rt)或其變體、或者tgirttm或其變體。

11、在一個實(shí)施方案中，方法包括在rt-pcr、qrt-pcr、用于rna結(jié)構(gòu)映射的毛細(xì)管電泳(ce)、轉(zhuǎn)錄組分析、細(xì)胞內(nèi)測序、下一代rna測序(rna-seq)、納米孔測序、pacbio測序、零模式波導(dǎo)測序、cdna文庫合成或cdna合成測定、或其任意組合中。

12、在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于從rna模板生成cdna分子的逆轉(zhuǎn)錄測定，方法包括使rna模板與包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜交dna-rna序列的tso接觸，其中tso能夠通過與在通過逆轉(zhuǎn)錄酶的非模板化添加過程中已添加至目標(biāo)核酸分子的5’端的非模板化核苷酸進(jìn)行堿基配對而退火，并且其中tso進(jìn)一步包含3’端修飾和5’端修飾中的至少一者、逆轉(zhuǎn)錄(rt)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶。

13、在一個實(shí)施方案中，rt引物選自由dna引物、rna引物和包含至少一個修飾的寡核苷酸的引物組成的組。

14、在一個實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄酶是marathonrt或其變體、莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(mmlv?rt)或其變體、鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(amv?rt)或其變體、hiv逆轉(zhuǎn)錄酶(hiv?rt)或其變體、家蠶r2rna元件逆轉(zhuǎn)錄酶(r2rt)或其變體、或者tgirttm或其變體。

15、在一個實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄在包含peg8000的緩沖液中進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄在包含licl的緩沖液中進(jìn)行。

16、在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于進(jìn)行從rna模板生成cdna分子的測定的試劑盒，方法包括使rna模板與包含dna核苷酸序列、rna核苷酸序列、修飾的核苷酸序列或雜合dna-rna序列的tso接觸，其中tso能夠通過與在通過逆轉(zhuǎn)錄酶的非模板化添加過程中已添加至目標(biāo)核酸分子的5’端的非模板化核苷酸進(jìn)行堿基配對而退火，并且其中tso進(jìn)一步包含3’端修飾和5’端修飾中的至少一者、逆轉(zhuǎn)錄(rt)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶。

17、在一個實(shí)施方案中，rt引物是dna引物、rna引物或包含至少一個修飾的寡核苷酸的引物。

18、在一個實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄酶是marathonrt或其變體、莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(mmlv?rt)或其變體、鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(amv?rt)或其變體、hiv逆轉(zhuǎn)錄酶(hiv?rt)或其變體、家蠶r2rna元件逆轉(zhuǎn)錄酶(r2rt)或其變體、以及tgirttm或其變體。

19、在一個實(shí)施方案中，試劑盒包含含有peg8000的緩沖液。在一個實(shí)施方案中，試劑盒包含含有l(wèi)icl的緩沖液。

20、在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(tso)，其包含：

21、(i)dna核苷酸序列、rna核苷酸序列或雜合dna-rna序列；和

22、(ii)3’端修飾和5’端修飾中的至少一者。

23、在一個實(shí)施方案中，tso包含3’端修飾。在一個實(shí)施方案中，tso包含5’端修飾。在一個實(shí)施方案中，tso包含3’端修飾和5’端修飾兩者。

24、在一個實(shí)施方案中，3’端修飾是核苷酸糖修飾或核堿基修飾。

25、在一個實(shí)施方案中，3’端修飾是去除3’羥基的修飾或阻斷3’羥基的修飾。

26、在一個實(shí)施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

27、在一個實(shí)施方案中，5’端修飾是核苷酸糖修飾或核堿基修飾。

28、在一個實(shí)施方案中，5’端修飾包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補(bǔ)骨脂素。

29、在一個實(shí)施方案中，3’端修飾是去除3’羥基的修飾或阻斷3’羥基的修飾。

30、在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少5個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少3個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。

31、在一個實(shí)施方案中，5’端包含至少一個非天然核苷酸或核苷酸類似物。

32、在一個實(shí)施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

33、在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種減少模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(tso)的多聯(lián)化的方法，所述方法包括提供包含tso、逆轉(zhuǎn)錄(rt)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)混合物，

34、其中tso包含：

35、(i)3’端修飾；和/或

36、(ii)5’端修飾。

37、在一個實(shí)施方案中，多聯(lián)化減少例如根據(jù)參考標(biāo)準(zhǔn)的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。

38、在一個實(shí)施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

39、在一個實(shí)施方案中，tso包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補(bǔ)骨脂素的5’端修飾。

40、在一個實(shí)施方案中，tso的5’端包含至少3個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。

41、在一個實(shí)施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

42、在一個實(shí)施方案中，tso包含seq?id?no：3。

43、在一個實(shí)施方案中，rt引物包含seq?id?no：2。

44、在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種減少來自模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(tso)的非特異性逆轉(zhuǎn)錄的方法，所述方法包括提供包含tso、逆轉(zhuǎn)錄(rt)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)混合物，

45、其中tso包含：

46、(i)3’端修飾；和/或

47、(ii)5’端修飾。

48、在一個實(shí)施方案中，多聯(lián)化減少例如根據(jù)參考標(biāo)準(zhǔn)的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。

49、在一個實(shí)施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

50、在一個實(shí)施方案中，tso包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補(bǔ)骨脂素的5’端修飾。

51、在一個實(shí)施方案中，tso的5’端包含至少3個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。

52、在一個實(shí)施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

53、在一個實(shí)施方案中，tso包含seq?id?no：3。

54、在一個實(shí)施方案中，rt引物包含seq?id?no：2。

55、在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種增加rna-seq文庫中目標(biāo)多核苷酸序列的產(chǎn)量的方法，所述方法包括提供包含tso、逆轉(zhuǎn)錄(rt)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)混合物，

56、其中tso包含：

57、(i)3’端修飾；和/或

58、(ii)5’端修飾。

59、在一個實(shí)施方案中，多聯(lián)化減少例如根據(jù)參考標(biāo)準(zhǔn)的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。

60、在一個實(shí)施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

61、在一個實(shí)施方案中，tso包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補(bǔ)骨脂素的5’端修飾。

62、在一個實(shí)施方案中，tso的5’端包含至少3個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。

63、在一個實(shí)施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

64、在一個實(shí)施方案中，tso包含seq?id?no：3。

65、在一個實(shí)施方案中，rt引物包含seq?id?no：2。

66、在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種增加rna-seq文庫的特異性的方法，所述方法包括提供包含tso、逆轉(zhuǎn)錄(rt)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)混合物，

67、其中tso包含：

68、(i)3’端修飾；和/或

69、(ii)5’端修飾。

70、在一個實(shí)施方案中，多聯(lián)化減少例如根據(jù)參考標(biāo)準(zhǔn)的約1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％。

71、在一個實(shí)施方案中，3’端修飾是3’ddt、3’ddu、3’反向dt、3’c3間隔子、3’氨基、被高碘酸鹽氧化的3’ru、3’磷酸化、3’氟代、3’醛、3’羧酸或羧酸酯、3’硫醇基、3’o-甲基、3’疊氮基、3’炔烴、3’烯烴、3’(ch2)n-x(x＝h、och3、ch3、sh、nh2、oh等；n≥1)或3’(ch2ch2o)n(n≥1)。

72、在一個實(shí)施方案中，tso包含三苯甲基、trebbler、樹枝狀高分子、生物素、熒光染料、rox?nhs酯、(ch2)n(n≥1)長間隔子、棕櫚酸亞磷酰胺、3-氰基乙烯基咔唑亞磷酰胺、膽固醇基或補(bǔ)骨脂素的5’端修飾。

73、在一個實(shí)施方案中，tso的5’端包含至少3個連續(xù)的脫堿基位點(diǎn)。

74、在一個實(shí)施方案中，tso在5’端包含至少一個異脫氧胞嘧啶(iso-dc)、異脫氧鳥苷(iso-dg)或者iso-dc和iso-dg的組合。

75、在一個實(shí)施方案中，tso包含seq?id?no：3。

76、在一個實(shí)施方案中，rt引物包含seq?id?no：2。