本發(fā)明屬于多核苷酸領(lǐng)域，具體涉及編碼多肽的人工多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸特別適用于基因疫苗接種。

背景技術(shù)：

1、基因疫苗接種和基因治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中最具前景且發(fā)展迅速的兩個(gè)治療領(lǐng)域。它們都基于將多核苷酸例如dna或rna分子遞送至患者的細(xì)胞或組織中，以產(chǎn)生具有治療效果的多肽。

2、在基因治療和疫苗接種中使用rna通常被認(rèn)為比使用dna更安全，因?yàn)閞na不存在穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組中的風(fēng)險(xiǎn)。此外，rna在體內(nèi)更容易降解，使得與dna相比其半衰期相對較短。因此，與基于dna的療法相比，基于rna的療法具有更低的宿主產(chǎn)生可降低療法的有效性并產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用的不期望的抗rna抗體的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在許多情況下，rna被認(rèn)為是基因醫(yī)學(xué)治療的首選分子。

3、基于rna的治療的主要限制之一是其有限的蛋白質(zhì)生產(chǎn)效率。由于rna的半衰期相對較短，關(guān)鍵是它們提供極高的翻譯速率，以在rna降解前產(chǎn)生足夠量的所需的蛋白質(zhì)。已有通過合理設(shè)計(jì)5’非翻譯區(qū)(utr)來嘗試優(yōu)化utr以提高蛋白質(zhì)生產(chǎn)；然而，迄今所獲進(jìn)展仍極為有限。

4、因此，盡管近年來已經(jīng)作出了努力，仍需要適用于基因疫苗接種和基因治療的具有高翻譯效率的多核苷酸，特別是rna。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)出一種新的核酸序列，當(dāng)將其插入5'utr的3'-末端時(shí)，可顯著增強(qiáng)mrna轉(zhuǎn)錄本的翻譯效率。這種新序列可用于構(gòu)建具有極高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的人工轉(zhuǎn)錄本，適用于多種應(yīng)用，包括核酸治療或工業(yè)重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

2、如以下實(shí)施例中所示，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄本的5'-utr的3'-末端僅插入序列5'-gccacc-3'的一個(gè)重復(fù)序列(repeat)均不影響其體外或體內(nèi)的蛋白質(zhì)生成能力(參見圖1和2，r2與r1對比)。然而，當(dāng)插入所述序列的兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列(tandem?repeats)時(shí)，在體外(見圖1，r3與r1對比)和體內(nèi)(見圖2，r3與r1對比)都觀察到蛋白質(zhì)產(chǎn)量的顯著增加，這在僅存在一個(gè)重復(fù)序列時(shí)完全沒有觀察到任何效果的情況下是完全出乎意料的。

3、值得注意的是，兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的存在所提供的協(xié)同效應(yīng)使得在24小時(shí)后，與不包含這兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄本相比，體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)增加了約400％(圖2，r3與r1或r2對比)，并且也優(yōu)于包含商業(yè)rna調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄本(圖2，r3與r4或r6對比)或先前公開的rna轉(zhuǎn)錄本(圖2，r3與r5對比)。

4、因此，從下文提供的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的多核苷酸代表一種克服目前人工rna的局限性，特別是克服它們的低蛋白生產(chǎn)效率的重要新工具。此外，本發(fā)明多核苷酸的較高翻譯效率可以使得基因疫苗接種所需的rna治療劑量降低，從而可以有助于減少相關(guān)的繼發(fā)效應(yīng)。

5、在第一方面，本發(fā)明提供一種人工多核苷酸，其在5'至3'方向包含一個(gè)5'非翻譯區(qū)(5'-utr)和一個(gè)開放閱讀框架(orf)，其中，5'-utr在其3'-末端包含有效地連接至orf的序列5’-gccncc-3’的至少兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，其中n是任意核苷酸。

6、在第二方面，本發(fā)明提供一種dna構(gòu)建體，其包含有效地連接至編碼第一方面所定義的多核苷酸序列的啟動子。

7、在第三方面，本發(fā)明提供一種包含如第二方面所定義的dna構(gòu)建體的表達(dá)載體。

8、在第四方面，本發(fā)明提供一種細(xì)胞，其包含如第一方面所定義的多核苷酸、如第二方面所定義的dna構(gòu)建體，或如第三方面所定義的表達(dá)載體。

9、在第五方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含脂質(zhì)納米顆粒和第一方面所定義的多核苷酸、第二方面所定義的dna構(gòu)建體或第三方面所定義的表達(dá)載體。

10、在第六方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含治療有效量的根據(jù)第一方面所述的多核苷酸、根據(jù)第二方面所述的dna構(gòu)建體、根據(jù)第三方面所述的表達(dá)載體或根據(jù)第五方面所述的組合物，以及至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體。

11、當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸包括編碼與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的orf時(shí)，上述各方面均可作為藥物使用。因此，在第七方面，本發(fā)明提供根據(jù)第一方面所述的多核苷酸、根據(jù)第二方面所述的dna構(gòu)建體、根據(jù)第三方面所述的表達(dá)載體、根據(jù)第四方面所述的細(xì)胞、根據(jù)第五方面所述的組合物或根據(jù)第六方面所述的藥物組合物用于醫(yī)藥中。

12、第八方面，本發(fā)明提供根據(jù)第一方面所述的多核苷酸、根據(jù)第二方面所述的dna構(gòu)建體、根據(jù)第三方面所述的表達(dá)載體、根據(jù)第四方面所述的細(xì)胞、根據(jù)第五方面所述的組合物或根據(jù)第六方面所述的藥物組合物用于誘導(dǎo)受試者中免疫應(yīng)答的方法中。

13、這方面也可以表述為多核苷酸、dna構(gòu)建體、表達(dá)載體、組合物、細(xì)胞或藥物組合物用于制備誘導(dǎo)受試者中免疫應(yīng)答的藥物中的用途。這方面也可以表述為一種誘導(dǎo)受試者中免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向有需要的受試者給藥治療有效量的本發(fā)明的多核苷酸、dna構(gòu)建體、表達(dá)載體、組合物、細(xì)胞或藥物組合物。

14、在第九方面，本發(fā)明提供根據(jù)第一方面所述的多核苷酸、根據(jù)第二方面所述的dna構(gòu)建體、根據(jù)第三方面所述的表達(dá)載體、根據(jù)第四方面所述的細(xì)胞、根據(jù)第五方面所述的組合物或根據(jù)第六方面所述的藥物組合物用于受試者的治療性免疫接種的方法中。

15、這方面也可表述為使用多核苷酸、dna構(gòu)建體、表達(dá)載體、組合物、細(xì)胞或藥物組合物用于制備用于受試者的治療性免疫接種的藥物中的用途。這方面也可一種用于受試者的治療性免疫接種的方法，所述方法包括向有需要的受試者給藥治療有效量的本發(fā)明的多核苷酸、dna構(gòu)建體、表達(dá)載體、組合物、細(xì)胞或藥物組合物。

16、在第十方面，本發(fā)明提供根據(jù)第一方面所述的多核苷酸、根據(jù)第二方面所述的dna構(gòu)建體、根據(jù)第三方面所述的表達(dá)載體、根據(jù)第四方面所述的細(xì)胞、根據(jù)第五方面所述的組合物或根據(jù)第六方面所述的藥物組合物用作疫苗或用于基因治療。

17、在第十一方面，本發(fā)明提供一種在細(xì)胞中生成多肽的體外方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與第一方面所定義的多核苷酸、第二方面所定義的dna構(gòu)建體、第三方面所定義的表達(dá)載體、第五方面所定義的組合物或第六方面所定義的藥物組合物接觸。

18、在第十二方面，本發(fā)明提供一種提高多核苷酸翻譯速率的體外方法，所述多核苷酸以5'至3'方向包含5'非翻譯區(qū)(5'-utr)和開放閱讀框架(orf)，所述方法包括在5'-utr的3'-末端插入序列5'-gccncc-3'的至少兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的步驟，其中n是任意核苷酸。

19、在第十三方面，本發(fā)明提供一種疫苗接種試劑盒，包括(a)如第一方面所定義的多核苷酸，如第二方面所定義的dna構(gòu)建體，如第三方面所定義的dna載體，如第四方面所定義的表達(dá)載體，或如第五方面所定義的組合物；(b)藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體；(c)任選的佐劑；以及(d)任選的其用法的說明書。

20、第十四方面，本發(fā)明提供一種制備根據(jù)第六方面的藥物組合物的方法，包括將本發(fā)明的多核苷酸、dna構(gòu)建體、表達(dá)載體或組合物與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體混合的步驟。