本發(fā)明涉及共聚聚羥基烷酸酯混合物的制造方法及轉(zhuǎn)化微生物。

背景技術：

1、聚羥基烷酸酯(以下有時稱為“pha”)是由廣范的微生物產(chǎn)生的聚酯型有機聚合物。pha是具有生物分解性的熱塑性高分子，可以以可再生資源作為原料進行生產(chǎn)。由此，嘗試了以pha作為環(huán)保型原材料或生物相容型原材料進行工業(yè)生產(chǎn)并用于多種產(chǎn)業(yè)的嘗試。

2、目前為止，已知大量微生物以pha作為儲能物質(zhì)蓄積于菌體內(nèi)。作為p?ha的代表例，可以舉出作為3-羥基丁酸(以下有時也稱為“3hb”)的均聚物的聚-3-羥基丁酸(以下有時也稱為“p(3hb)”)。p(3hb)為熱塑性高分子，由于在自然環(huán)境中可生物分解，因此，作為對環(huán)境友好的塑料而備受矚目。但是，p(3hb)的結(jié)晶性高，因此具有硬且脆的性質(zhì)，在實際使用上應用范圍受到限制。為了擴大應用范圍，需要對p(3hb)賦予柔軟性。

3、為了提高pha的柔軟性，對于由3hb和3-羥基己酸(以下稱為“3hh”)形成的共聚聚羥基烷酸酯(以下也稱為“p(3hb-co-3hh)”)及其制造方法進行了研究(例如，參照專利文獻1及專利文獻2)。在這些報告中，p(3hb-co-3h?h)是使用由土壤分離的豚鼠氣單胞菌(aeromonas?caviae)的野生株以油酸、棕櫚酸等脂肪酸作為碳源而發(fā)酵生產(chǎn)的。

4、另外，也進行了以殺蟲貪銅菌(cupriavidus?necator)作為宿主并利用來源于豚鼠氣單胞菌的pha合成酶大量生產(chǎn)p(3hb-co-3hh)的研究。通過對于具有來源于豚鼠氣單胞菌的pha合成酶的殺蟲貪銅菌導入r體特異性烯酰co?a水合酶基因，或者通過增加宿主染色體上的r體特異性烯酰coa水合酶基因的表達量，以植物油脂作為原料而生產(chǎn)p(3hb-co-3hh)，可將該p(3hb-co-3hh)的3hh組成比率提高至最大14mol％左右(參照專利文獻3、專利文獻4及非專利文獻1)。

5、此外，也有對于具有來源于豚鼠氣單胞菌的pha合成酶的殺蟲貪銅菌，通過抑制編碼β-酮硫解酶的基因的表達而將p(3hb-co-3hh)的3hh組成比率提高至20mol％以上的例子(參照專利文獻5)，所述β-酮硫解酶具有對于碳原子數(shù)6的β-酮?；?coa(即，β-酮己?；?coa)的硫解活性。

6、也進行了與p(3hb-co-3hh)的物性相關的研究(參照非專利文獻2)。在該報告中，以碳原子數(shù)為12以上的脂肪酸作為唯一碳源對豚鼠氣單胞菌進行培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)了具有各種3hh組成比率的p(3hb-co-3hh)。p(3hb-co-3hh)的結(jié)晶性隨著3hh組成比率的增加而降低，因此，從p(3hb)那樣的硬且脆的性質(zhì)逐漸顯示出柔軟的性質(zhì)，3hh組成比率進一步提高時，顯示出比p(3hb-co-3hv)更高的柔軟性。即，p(3hb-co-3hh)能夠通過改變3hh組成比率而具有從硬質(zhì)聚合物至軟質(zhì)聚合物的可應用范圍寬廣的物性，可以期待在廣泛領域中的應用。

7、另一方面，盡管在使3hh組成比率上升時，p(3hb-co-3hh)的結(jié)晶性降低而柔軟性提高，但具有加工特性降低的傾向。例如，雖然將3hh組成比率提高至10摩爾％左右的p(3hb-co-3hh)較軟質(zhì)，但在注塑成型、膜成型、吹塑成型、纖維的紡絲、擠出發(fā)泡、珠粒發(fā)泡等加工中結(jié)晶化速度慢，因此存在生產(chǎn)性低的課題。

8、為了解決這樣的課題，也進行了通過將單體組成互不相同的多種pha混合而兼顧加工性和物性的研究(參照專利文獻6)。

9、微生物所生成的pha會蓄積于微生物的菌體內(nèi)，因此，為了利用pha作為塑料，需要從微生物的菌體內(nèi)分離/純化pha的工序。在分離/純化pha的工序中，在將含有pha的微生物的菌體破碎、或?qū)⒊齪ha以外的生物來源成分可溶化之后，從得到的水性懸浮液取出pha。此時，進行例如離心分離、過濾、干燥等分離操作。干燥操作中可使用噴霧干燥機、流化床干燥機、滾筒干燥機等，從操作簡便的方面出發(fā)，優(yōu)選使用噴霧干燥機。

10、根據(jù)本發(fā)明人等的經(jīng)驗，通過在噴霧干燥時適當?shù)卣{(diào)節(jié)熱風溫度，使pha粒子的表面稍微熔融并熔粘，可以造粒成期望大小的粒徑。造粒后的pha從處理的容易性、輸送容易性的觀點出發(fā)是有用的。pha的熔點取決于其共聚比率。例如，3hh組成比率高的pha(9mol％左右以上)的熔點較低，因此能夠以較低溫使粒子表面熔融而進行造粒。另一方面，3hh組成比率低的pha(8mol％左右以下)的熔點較高，為了將其造粒，需要將熱風溫度設定為高溫，從節(jié)能、安全性的觀點出發(fā)，仍有改進的余地。

11、專利文獻7中記載了通過將包含3hh組成比率為0～8％的pha和3hh組成比率為9～25％的pha且ph為7以下的水性懸浮液進行噴霧干燥，即使在低的熱風溫度下也能夠制造粒徑大的pha粉體。

12、另外，已報告了在一種微生物中共同生產(chǎn)多種pha的技術(例如，參照專利文獻8～10)，但關于高熔點且適合噴霧干燥的pha的生產(chǎn)，并沒有公開。

13、現(xiàn)有技術文獻

14、專利文獻

15、專利文獻1：日本特開平5-93049號公報

16、專利文獻2：日本特開平7-265065號公報

17、專利文獻3：國際公開第2011/105379號

18、專利文獻4：國際公開第2015/115619號

19、專利文獻5：國際公開第2019/142845號

20、專利文獻6：國際公開第2020/195550號

21、專利文獻7：國際公開第2021/251049號

22、專利文獻8：國際公開第2015/146195號

23、專利文獻9：國際公開第2017/056442號

24、專利文獻10：國際公開第2021/206155號

25、非專利文獻

26、非專利文獻1：h.arikawa,k.matsumoto,microb.cell.fact.,15,pp.184(2016)

27、非專利文獻2：y.doi,s.kitamura,h.abe,macromolecules,28,pp.4822-4823(1995)

技術實現(xiàn)思路

1、發(fā)明要解決的課題

2、如上所述，在3hh組成比率低、熔點高的pha的造粒方面存在課題。

3、根據(jù)專利文獻7中記載的方法，能夠得到以高熔點pha作為主成分且造粒性得到改善的pha，但在該制造中，在分別制造2種pha之后，各自進行純化，制備了各自的水性懸浮液后，將它們合并而成的水性懸浮液進行噴霧干燥(參照各實施例)。由于需要這樣將2種pha分別進行制造/純化，因此效率不高。

4、鑒于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供以高熔點pha作為主成分且造粒性得到了改善的共聚聚羥基烷酸酯混合物的高效的制造方法。

5、解決課題的方法

6、本發(fā)明人為了解決上述課題而進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過對微生物進行培養(yǎng)，生產(chǎn)具有特定組成的包含2種聚羥基烷酸酯級分的共聚聚羥基烷酸酯混合物，能夠高效地制造以高熔點pha作為主成分且造粒性得到了改善的共聚聚羥基烷酸酯混合物，從而完成了本發(fā)明。

7、即，本發(fā)明涉及一種制造共聚聚羥基烷酸酯混合物的方法，該方法包括：對生產(chǎn)上述共聚聚羥基烷酸酯混合物的微生物進行培養(yǎng)的工序，

8、上述共聚聚羥基烷酸酯混合物含有聚羥基烷酸酯級分(i)及聚羥基烷酸酯級分(ii)，

9、所述聚羥基烷酸酯級分(i)包含具有3-羥基丁酸結(jié)構單元及3-羥基己酸結(jié)構單元的共聚聚羥基烷酸酯、并且平均3-羥基己酸組成比率為9摩爾％以上且小于20摩爾％，

10、所述聚羥基烷酸酯級分(ii)包含具有3-羥基丁酸結(jié)構單元的聚羥基烷酸酯、并且平均3-羥基己酸組成比率為0摩爾％以上且8摩爾％以下，

11、上述共聚聚羥基烷酸酯混合物中的上述聚羥基烷酸酯級分(ii)的重量比例為45％以上。

12、另外，本發(fā)明也涉及一種轉(zhuǎn)化微生物，其是產(chǎn)生共聚聚羥基烷酸酯混合物的轉(zhuǎn)化微生物，

13、上述轉(zhuǎn)化微生物具有編碼對(r)-3-羥基己?；?coa的聚合活性互不相同的2種聚羥基烷酸酯合成酶的基因，

14、上述共聚聚羥基烷酸酯混合物含有聚羥基烷酸酯級分(i)及聚羥基烷酸酯級分(ii)，

15、所述聚羥基烷酸酯級分(i)包含具有3-羥基丁酸結(jié)構單元及3-羥基己酸結(jié)構單元的共聚聚羥基烷酸酯、并且平均3-羥基己酸組成比率為9摩爾％以上且小于20摩爾％，

16、所述聚羥基烷酸酯級分(ii)包含具有3-羥基丁酸結(jié)構單元的聚羥基烷酸酯、并且平均3-羥基己酸組成比率為0摩爾％以上且8摩爾％以下，

17、上述共聚聚羥基烷酸酯混合物中的上述聚羥基烷酸酯級分(ii)的重量比例為45％以上。

18、發(fā)明的效果

19、根據(jù)本發(fā)明，能夠高效地制造以高熔點pha作為主成分且改善了造粒性的共聚聚羥基烷酸酯混合物。根據(jù)本發(fā)明，不需要分別生產(chǎn)共聚聚羥基烷酸酯混合物所包含的各聚羥基烷酸酯并進行混合，能夠通過一次性微生物培養(yǎng)/純化而得到共聚聚羥基烷酸酯混合物。

20、另外，通過在一個微生物細胞內(nèi)同時生產(chǎn)各種聚羥基烷酸酯，能夠得到混合狀態(tài)優(yōu)異的共聚聚羥基烷酸酯混合物，因此，在為了作為塑料代替產(chǎn)品而使用的混煉/成型加工工藝中，容易確保均勻性，從實際使用時的物性方面考慮也是有利的。

21、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，可以通過噴霧干燥來得到共聚聚羥基烷酸酯混合物的粉體。另外，即使噴霧干燥時為較低的干燥溫度，也能夠造粒成期望的大小的粒徑，從節(jié)能、安全性的觀點考慮是有利的。