本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，特別是涉及一種雙靶向cd38和bcma且分泌il-10的串并聯(lián)混合型car-t細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiple?myeloma，mm)是一種克隆性漿細(xì)胞異常增殖的惡性疾病，是血液系統(tǒng)第二大常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率很高，我國發(fā)病率約為十萬分之一點(diǎn)六。盡管過去十年中治療手段如自體干細(xì)胞移植、免疫調(diào)節(jié)酰亞胺藥物(沙利度胺和來那度胺)、蛋白酶體抑制劑(pi)等新型藥物的開發(fā)顯著提高了患者的生存率，5年總生存期可達(dá)40％～87％。但大多數(shù)患者最終會發(fā)展為難治性疾病并復(fù)發(fā)，故仍需安全長效的藥物(roex?et?al.,2020,mishra?et?al.,2023)。

2、嵌合抗原受體(chimericantigen?receptor,car)t細(xì)胞治療是血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的一種突破性創(chuàng)新策略，已在臨床中顯示出顯著療效。b細(xì)胞成熟抗原(b?cellmaturationantigen,bcma)在腫瘤漿細(xì)胞上選擇性表達(dá)，被認(rèn)為是多發(fā)性骨髓瘤靶向治療理想的靶點(diǎn)。目前已有幾款bcma?car-t細(xì)胞批準(zhǔn)于臨床使用，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明bcmacar-t細(xì)胞對多發(fā)性骨髓瘤有顯著療效，客觀緩解率30％到97％不等(zhang?et?al.,2022)。然而，部分患者治療失敗或在治療后短時(shí)間內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)，原因可能是腫瘤細(xì)胞中抗原的克隆進(jìn)化和丟失、骨髓微環(huán)境中的免疫抑制或car-t細(xì)胞耗竭(zhang?et?al.,2023)。

3、現(xiàn)有療法的局限性之一是復(fù)發(fā)率高，盡管新藥提高了生存率，大多數(shù)mm患者最終會復(fù)發(fā)并發(fā)展為難治性疾病。其二抗原逃逸，bcma?car-t治療后，腫瘤細(xì)胞可能通過bcma的下調(diào)或丟失來逃避免疫監(jiān)視。其三是免疫抑制和car-t細(xì)胞耗竭，骨髓微環(huán)境中的免疫抑制和car-t細(xì)胞耗竭限制了治療效果的持久性。

4、解決抗原逃逸的一種方法是使用雙靶向car-t細(xì)胞。cd38是一種單鏈ⅱ型跨膜糖蛋白，在骨髓瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，也是多發(fā)性骨髓瘤理想的治療靶點(diǎn)(liao?et?al.,2023)。daratumumab和isatuximab是兩種抗cd38單克隆抗體，可通過多種作用機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞快速凋亡，延長患者生存期，對髓系細(xì)胞生長無嚴(yán)重抑制作用，已批準(zhǔn)用于臨床治療(denovellis?et?al.,2022,van?de?donk?et?al.,2018)。同時(shí)，cd38靶向car-t細(xì)胞在臨床前研究中顯示出抗mm活性(li?et?al.,2023)。

5、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(interleukin-10,il10)是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可以減輕炎癥反應(yīng)(moore?et?al.,2001)。il-10與car-t細(xì)胞聯(lián)合使用，可以使car-t細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中保持完整的線粒體結(jié)構(gòu)和功能，對抗腫瘤微環(huán)境中的t細(xì)胞功能障礙(heuser-loy,2024)。此外，文獻(xiàn)報(bào)道，il-10與骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derivedsuppressor?cell，mdsc)和調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(regulatory?cells，tregs)的發(fā)育呈負(fù)相關(guān)，破壞了腫瘤免疫抑制，進(jìn)而有助于減少腫瘤的發(fā)展、生長和轉(zhuǎn)移(tanikawaetal.,2012)。然而，il-10的聯(lián)合治療存在需要采用瘤周給藥以減少全身不良反應(yīng)的問題，治療便利性欠佳。開發(fā)一種可以將il-10有效輸送到作用部位且全身副作用最小的臨床應(yīng)用是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

6、由此可見，現(xiàn)有單靶向bcma的car-t細(xì)胞在治療mm的過程中存在耐藥和car-t細(xì)胞在體內(nèi)持久性不佳的問題，有必要研發(fā)新的雙靶向cd38與bcma且能分泌il-10的car-t細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)了雙靶向cd38和bcma的car，以增強(qiáng)car-t細(xì)胞靶向殺傷能力與緩解car-t細(xì)胞的耗竭，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)雙靶向cd38和bcma且包含il-10的串并聯(lián)混合型car，其中包含抗bcma單鏈可變片段(scfv)和人源化抗cd38?scfv和分泌型il-10肽段，并以此制備表達(dá)雙靶向cd38和bcma且分泌il10的串并聯(lián)混合重組載體，進(jìn)一步制備了car-t細(xì)胞，主要解決的技術(shù)問題包括：一是通過雙靶向cd38和bcma兩個(gè)細(xì)胞表面抗原，解決car-t治療中抗原逃逸的問題；二是通過共表達(dá)il-10提高終末耗竭car-t細(xì)胞的存活和增殖，增強(qiáng)抗腫瘤殺傷活性。

2、因此，在第一方面，發(fā)明提供了一種雙靶向cd38和bcma且包含il-10的串并聯(lián)混合型嵌合抗原受體(hcd38-bcma-il10-car)，其包含以下元件：

3、1)信號肽1；2)抗cd38抗體a；3)連接子2；4)抗bcma重鏈區(qū)；5)連接子1；6)抗bcma輕鏈區(qū)；7)il-15r胞外區(qū)；8)鉸鏈區(qū)；9)跨膜區(qū)；10)il-15r胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)；11)胞內(nèi)信號共刺激區(qū)；12)胞內(nèi)信號刺激區(qū)；13)2a序列；14)信號肽2；15)抗cd38抗體b；16)連接子3；17)il-15序列；18)2a序列；以及19)人il-10序列，

4、其中所述抗cd38抗體a或抗cd38抗體b的氨基酸序列如seq?id?no:4-13中任一條所示；

5、并且其中，抗bcma重鏈區(qū)與抗bcma輕鏈區(qū)位置可以互換，并且抗cd38抗體區(qū)和含抗bcma重鏈區(qū)、連接子1和抗bcma輕鏈區(qū)的抗bcma抗體區(qū)的位置可以互換。

6、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，抗cd38抗體區(qū)和含抗bcma重鏈區(qū)、連接子1和抗bcma輕鏈區(qū)的抗bcma抗體區(qū)形成串并聯(lián)混合型雙鏈結(jié)構(gòu)。

7、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，抗bcma重鏈區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:14所示，抗bcma重鏈區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:15所示。

8、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，信號肽1和信號肽2可以為任一種哺乳動物細(xì)胞表面蛋白的信號肽，優(yōu)選，所述信號肽為人白蛋白信號肽，人胰島素信號肽或者鼠igg?kappa信號肽，其氨基酸序列分別如seq?id?no:1、2或3所示。

9、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，二聚化序列的氨基酸序列如seq?id?no:16所示。

10、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)可以為人cd8或者人il-15r的鉸鏈區(qū)，優(yōu)選，鉸鏈區(qū)為人il-15r的鉸鏈區(qū)，其氨基酸序列如seq?id?no:18所示。

11、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，跨膜區(qū)可以為人cd8或者人il-15r的跨膜區(qū)，優(yōu)選，跨膜區(qū)為人il-15r的跨膜區(qū)，其氨基酸序列如seq?id?no:19所示。

12、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，胞內(nèi)信號共刺激區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:21所示。

13、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，胞內(nèi)信號刺激區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:22所示。

14、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，2a序列的氨基酸序列如seq?id?no:23所示。

15、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，il-15r胞外區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:17所示。

16、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，il-15r胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:20所示；il-15序列的氨基酸序列如seq?id?no:24所示。

17、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，連接子1、2、3的氨基酸序列如seq?id?no:16所示。

18、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，人il-10序列的氨基酸序列如seq?id?no:25所示。

19、在第二方面，本發(fā)明提供了編碼雙靶向cd38和bcma且包含il-10的串并聯(lián)混合型嵌合抗原受體(hcd38-bcma-il10-car)的核酸分子。

20、在第三方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，該載體包含第二方面的核酸分子。

21、在第四方面，本發(fā)明提供了一種重組慢病毒，該慢病毒包含第二方面的核酸分子或通過第三方面的表達(dá)載體而制備。

22、在第五方面，本發(fā)明提供了一種重組慢病毒的制備方法，包括用第三方面的表達(dá)載體和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細(xì)胞，以獲得重組慢病毒。

23、在第五方面的實(shí)施方案中，輔助質(zhì)粒可以為pmdlg-prre-kana、pmd2g-kana以及prsv-rev-kana。

24、在第五方面的實(shí)施方案中，哺乳動物宿主細(xì)胞可以為但不限于hek293細(xì)胞、人per.c6細(xì)胞、人hela細(xì)胞以及鼠cho細(xì)胞等，優(yōu)選hek293細(xì)胞。

25、在第六方面，本發(fā)明提供了表達(dá)雙靶向cd38和bcma的串并聯(lián)混合型嵌合抗原受體且分泌il-10的car-t細(xì)胞(hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞)，該細(xì)胞表達(dá)雙靶向cd38和bcma且包含il-10的串并聯(lián)混合型嵌合抗原受體(hcd38-bcma-il10-car)。

26、在第七方面，本發(fā)明提供了制備第六方面的hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞的方法，包括用第五方面的重組慢病毒轉(zhuǎn)染t細(xì)胞。

27、在本發(fā)明第七方面的實(shí)施方案中，制備第六方面的hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞的方法包括以下步驟：

28、(1)構(gòu)建攜帶編碼hcd38-bcma-il10-car的核苷酸序列的重組慢病毒表達(dá)載體；

29、(2)用重組慢病毒表達(dá)載體及輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，制備可感染t細(xì)胞的重組慢病毒；

30、(3)從供體提供的外周血中分離pbmc，使用磁珠分離、活化t細(xì)胞；

31、(4)用步驟(2)所得的重組慢病毒感染t細(xì)胞，產(chǎn)生表達(dá)hcd38-bcma-il10-car的t細(xì)胞。

32、在進(jìn)一步的實(shí)施方案種，輔助質(zhì)?？梢詾閜mdlg-prre-kana、pmd2g-kana以及prsv-rev-kana。

33、在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法還可以在步驟(4)之后包括以下步驟：

34、(5)將步驟(4)所得細(xì)胞體外培養(yǎng)；

35、(6)將步驟(5)所得細(xì)胞大量擴(kuò)增；以及

36、(7)收集表達(dá)hcd38-bcma-il10-car的t細(xì)胞。

37、在第八方面，本發(fā)明提供了一種疾病治療藥物，其包含本發(fā)明的編碼hcd38-bcma-il10-car的核酸分子、包含編碼hcd38-bcma-il10-car的核酸分子的表達(dá)載體、第四方面的重組慢病毒或本發(fā)明第六方面的hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞。

38、在第九方面，本發(fā)明提供了上述核酸分子、上述表達(dá)載體、上述重組慢病毒或上述hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞在制備疾病治療藥物中的應(yīng)用。

39、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，疾病是指以細(xì)胞表面高表達(dá)cd38分子和/或bcma分子為特征的疾病。在具體的實(shí)施方案中，疾病可以為多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及干燥綜合征等。

40、在本發(fā)明的實(shí)施方案中，car表示嵌合抗原受體，bcma-car表示靶向bcma的嵌合抗原受體，car-t細(xì)胞表示嵌合抗原受體t細(xì)胞，hcd38-bcma-il10-car表示雙靶向cd38和bcma且包含il-10的串并聯(lián)混合型嵌合抗原受體，bcma-car-t細(xì)胞表示靶向bcma的嵌合抗原受體t細(xì)胞，以及hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞表示表達(dá)雙靶向cd38和bcma的串并聯(lián)混合型嵌合抗原受體且分泌il-10的t細(xì)胞。

41、在本發(fā)明的語境中，串并聯(lián)混合型嵌合抗原受體是指含有兩條平行蛋白鏈且其中一條鏈含有兩個(gè)抗體而另一條鏈含有一個(gè)抗體的嵌合抗原受體，因此“雙靶向cd38和bcma的串并聯(lián)混合型嵌合抗原受體”是指含有分別靶向cd38和bcma兩條平行蛋白鏈且其中一條蛋白鏈含有前后相連的抗cd38和抗bcma兩個(gè)抗體而另一條鏈僅含抗cd38抗體的嵌合抗原受體。

42、本發(fā)明以cd38和bcma為靶點(diǎn)，得到具有特異性識別cd38和bcma抗原的抗體基因序列，具有唯一性和獨(dú)特性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建與制備的hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞在識別cd38陽性和/或bcma陽性腫瘤細(xì)胞上也有其唯一性和獨(dú)特性。本發(fā)明的hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞同時(shí)靶向多發(fā)性骨髓瘤的兩個(gè)表面標(biāo)志物cd38和bcma，可以有效避免抗原逃逸問題，防止因單個(gè)靶點(diǎn)丟失導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)；本發(fā)明的hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞在靶向cd38和bcma的基礎(chǔ)上分泌型il-10，提高細(xì)胞活性與增殖能力，緩解t細(xì)胞耗竭，增強(qiáng)car-t細(xì)胞殺傷活性，有效降低治療后腫瘤復(fù)發(fā)率，延長病人生存周期；本發(fā)明的hcd38-bcma-il10-car-t細(xì)胞對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞mm.1s-gfp的殺傷活性顯著高于普通t細(xì)胞與單靶點(diǎn)bcma-car細(xì)胞，使用低劑量的效應(yīng)細(xì)胞，即可對骨髓瘤細(xì)胞株mm.1s-gfp細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷，具有極佳的骨髓瘤靶向殺傷活性。