本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種動物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺癌是最常見惡性腫瘤之一，全球最新數(shù)據(jù)顯示肺癌發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位。肺癌主要分為非小細胞肺癌(non-small?cell?lung?cancer，nsclc)和小細胞肺癌(small?cell?lung?cancer，sclc)，其中非小細胞肺癌占所有肺惡性腫瘤的80-85％。若早期發(fā)現(xiàn)，nsclc的早期治療預(yù)后良好，i期的5年生存率為70％以上，但大多數(shù)患者(約75％)在診斷時已患有晚期疾病(iii/iv期)。探明早期肺癌的發(fā)生機制，明確肺癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵分子對肺癌的早期防治具有重要意義。

2、自發(fā)成瘤的肺癌小鼠模型，特別是那些攜帶表皮生長因子受體(egfr)突變的模型，對于深入理解肺癌的生物學(xué)特性和治療策略具有重要意義。egfr突變在非小細胞肺癌(nsclc)中是一個關(guān)鍵的致病因子，它驅(qū)動腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療抗性的產(chǎn)生。這些模型為研究者提供了一個獨特的工具，用于模擬人類肺癌的發(fā)展過程，從而促進對腫瘤生物學(xué)的深入了解。egfr突變自發(fā)成瘤的肺癌小鼠模型是肺癌研究中的一個強大工具，它們不僅能夠幫助科學(xué)家更好地理解肺癌的生物學(xué)機制，而且為開發(fā)新的治療策略和提高患者預(yù)后提供了實驗基礎(chǔ)。在未來，這些模型有望在肺癌的基礎(chǔ)和臨床研究中繼續(xù)發(fā)揮重要作用。

3、傳統(tǒng)的k-ras突變的醫(yī)學(xué)價值有限，因為東亞人群的非小細胞肺癌主要是egfr突變導(dǎo)致，l858r突變?yōu)橹饕蛔兾稽c。肺癌研究的傳統(tǒng)小鼠模型均不能模擬亞洲人egfr突變上皮細胞演進為早期、中期肺癌的過程(從基因突變-腫瘤發(fā)生-腫瘤發(fā)展)。基因工程小鼠模型可以通過對單個或多個驅(qū)動基因的組合獲得不同類型的肺癌小鼠模型。目前應(yīng)用及研究最廣泛的是kras-lsl-g12d突變的基因工程小鼠，但不同地區(qū)的非小細胞肺癌的分子流行病學(xué)有不同的比例，中國人群中egfr突變頻率(45-50％)遠高于歐洲(10-15％)或北美(15-20％)人群。

4、肺癌的演進是一個連續(xù)動態(tài)進展的過程，早期肺癌從基因突變的正常上皮到原位腺癌，進而發(fā)展為微創(chuàng)腺癌，再到浸潤性癌，經(jīng)歷了從正常上皮到不同浸潤程度(原位癌、微浸潤癌、浸潤性癌)早期肺癌的演進過程。傳統(tǒng)觀點認為免疫逃逸通常發(fā)生在實體瘤演進的晚期階段，然而，已有研究證明，早期肺癌也存在著免疫逃逸的證據(jù)。發(fā)生腫瘤逃逸的機制復(fù)雜，當前模型的主要缺點是移植受體為免疫缺陷宿主，這些宿主缺乏人類腫瘤微環(huán)境中存在的完整體液免疫反應(yīng)，不能反映人類疾病的免疫復(fù)雜性。共同移植腫瘤細胞與某一種微環(huán)境細胞，腫瘤細胞與微環(huán)境細胞的比率往往嚴重失衡，不能代表體內(nèi)該微環(huán)境細胞的性質(zhì)和群體比率，此外，體外培養(yǎng)的細胞亦有可能失去體內(nèi)的功能與表型異質(zhì)性。

5、因此，急需一種能更真實模擬腫瘤發(fā)生發(fā)展進程(從基因突變腫瘤發(fā)生-腫瘤發(fā)展)的小鼠模型。本領(lǐng)域目前無從基因突變腫瘤發(fā)生-腫瘤發(fā)展的科研用途的早期肺癌小鼠模型。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于根據(jù)肺癌患者的疾病特點，結(jié)合egfr突變早期肺癌的小鼠模型(lsl-egfr?l858rmut/wt,p53flox/flox小鼠)，滴注一定劑量的ad5-cc10-cre或ad5-spc-cre病毒30-60天能夠自發(fā)且快速的產(chǎn)生早期肺癌性狀、發(fā)病率達到100％且性狀穩(wěn)定。

2、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一種早期肺癌小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

4、1)將p53flox/flox小鼠與lsl-egfr?l858rmut/wt小鼠雜交后自交，獲得lsl-egfrl858rmut/wt,p53flox/flox小鼠；

5、2)對lsl-egfr?l858rmut/wt,p53flox/flox小鼠給藥上皮細胞特異性cre病毒，構(gòu)建動物模型早期肺癌小鼠。

6、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述上皮細胞特異性cre病毒為肺泡上皮細胞特異性cre病毒或支氣管上皮細胞特異性cre病毒。

7、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述支氣管上皮細胞特異性cre病毒為ad5-cc10-cre。

8、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述肺泡上皮細胞特異性cre病毒為ad5-spc-cre。

9、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述病毒的給藥方式包括但不限于支氣管滴注、尾靜脈注射等方式。

10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述cre病毒的給藥劑量為1×1012病毒滴度。

11、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述cre病毒滴注次數(shù)為1次或多次。

12、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述p53flox/flox動物的構(gòu)建方法為：將p53flox/wildtype小鼠交配產(chǎn)生雜合子，將雜合子自交，獲得p53flox/flox小鼠。

13、在本發(fā)明的一些實施方式中，p53flox/flox動物的構(gòu)建過程中通過pcr鑒定小鼠基因型。

14、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述pcr引物序列為：

15、f1-00460-trp53-d5-5tf1：5’-gggagttgtctttcgtgtgacct-3’；

16、r1-common?en2-r：5’-ccaactgaccttgggcaagaacat-3’；

17、f2-00460-trp53-3wt-tf2：5’-tatgagggacaaggtatggtgtc-3’；

18、r2-00460-trp53-3wt-tr2：5’-gggatattcacagaacacactgg-3’。

19、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述lsl-egfr?l858rmut/wt小鼠為將lsl-egfr?l858r基因敲入到小鼠h11位點。

20、在本發(fā)明的一些實施方式中，通過基因編輯技術(shù)將lsl-egfr?l858r基因敲敲入到小鼠h11位點。

21、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述基因編輯技術(shù)包括：be3，crispr/cas9，talen和zfn。

22、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述基因編輯技術(shù)為crispr/cas9。

23、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述lsl-egfr?l858rmut/wt小鼠的具體構(gòu)建過程為：

24、s1：構(gòu)建攜帶條件性過表達l858r突變序列的同源重組打靶載體；

25、s2：根據(jù)l858r突變基因的序列，設(shè)計并獲得sgrna，將所述sgrna與cas9蛋白共同孵育，制備cas9/sgrna混合物；

26、s3：將打靶載體、cas9/sgrna混合物注射入小鼠受精卵內(nèi)，獲得egfr?l858r突變的雜合小鼠lsl-egfr?l858rmut/wt。

27、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述同源重組打靶載體的序列如seq?id?no：1所示。

28、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述sgrna的序列為：ctgagccaacagtggtagta。

29、在本發(fā)明的一些實施方式中，lsl-egfr?l858rmut/wt小鼠的構(gòu)建過程中通過pcr鑒定小鼠基因型。

30、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述pcr引物序列為：

31、f1-h11-polya-3tf2：5’-cctcctctcctgactactcccagtc-3’；

32、r1-h11-tr2：5’-tcacagaaaccatatggcgctcc-3’；

33、f2-h11-wt-tf1：5’-cagcaaaacctggctgtggatc-3’；

34、r2-h11-wt-tr1：5’-atgagccaccatgtgggtgtc-3’；

35、本發(fā)明的第二方面，提供本發(fā)明第一方面所述的方法構(gòu)建的小鼠模型在研究疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制和/或篩選能夠預(yù)防、緩解或治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。

36、本發(fā)明的有益效果是：

37、本發(fā)明通過在非常小比例支氣管肺泡上皮中選擇性敲除p53的同時并激活egfr-l858r突變的表達，可成功構(gòu)建egfr突變自發(fā)成瘤的肺癌小鼠模型。通過病毒滴注的濃度與數(shù)量控制基因激活的細胞數(shù)量，在病毒滴注后的30-60天能夠自發(fā)且快速的產(chǎn)生早期肺癌性狀、發(fā)病率達到100％且性狀穩(wěn)定；利用上述方法構(gòu)建的自發(fā)性肺癌小鼠模型可應(yīng)用于肺癌靶向藥物篩選。