：本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料，具體涉及一種羅非魚膠原蛋白壓電水凝膠及其在制備治療組織損傷的生物材料中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、組織損傷的愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，涉及多種類型的組織，包括皮膚、骨骼、軟骨、肌肉等。不同類型的組織具有不同的愈合機(jī)制和時(shí)間框架，但整體過程通常包括以下幾個(gè)階段：炎癥、增殖和重塑，其中控制受損組織中炎癥反應(yīng)，血管再生等仍然是一個(gè)重大的臨床挑戰(zhàn)。生長因子被廣泛認(rèn)為能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，控制免疫微環(huán)境和血管生成，因此在損傷組織再生的應(yīng)用受到高度關(guān)注。然而，生長因子的使用存在高成本、應(yīng)用周期短以及局部濃度難以控制等問題，極大限制了其臨床應(yīng)用。此外，生長因子的穩(wěn)定性和在受損傷部位的持久作用時(shí)間短，常常需要重復(fù)施用，增加了患者的負(fù)擔(dān)和治療成本。

2、刺激能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、巨噬細(xì)胞極化以及血管再生等生物學(xué)過程。但目前常見的電刺激技術(shù)需要外部電源和電極，這不僅增加了設(shè)備成本，還可能帶來不便和不適感，限制了其在實(shí)際治療中的廣泛應(yīng)用。

3、凝膠作為一種理想的生物材料，廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中。然而，傳統(tǒng)水凝膠材料，特別是基于天然高分子的水凝膠(如膠原蛋白)，通常面臨降解速率不可控、力學(xué)性能較差、以及生物降解性較高等問題，這使得它們難以滿足臨床中對長期使用的要求。同時(shí)，傳統(tǒng)水凝膠的物理性能較難調(diào)控，限制了它們在不同組織損傷治療中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種羅非魚膠原蛋白壓電水凝膠及其在制備治療組織損傷的生物材料中的應(yīng)用，本發(fā)明提出的基于羅非魚膠原蛋白(col)的壓電水凝膠(col/og/btn水凝膠)，并通過引入氨基化鈦酸鋇(btn)和氧化結(jié)冷膠(og)來改善水凝膠的物理性能，同時(shí)在其內(nèi)融入壓電特性，從而避免了傳統(tǒng)電刺激裝置對外部電源的依賴。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種羅非魚膠原蛋白壓電水凝膠，所述的壓電水凝膠為膠原蛋白/氧化結(jié)冷膠/氨基化鈦酸鋇水凝膠(col/og/btn水凝膠)，呈現(xiàn)不規(guī)則的互聯(lián)多孔結(jié)構(gòu)，所述的壓電水凝膠的抗壓強(qiáng)度為46.26～95.74kpa，輸出電壓為4.47～90.59mv。

3、本發(fā)明提出的水凝膠的成分相互作用，羅非魚膠原蛋白、氧化結(jié)冷膠和氨基化鈦酸鋇協(xié)同作用，能夠在2min以內(nèi)快速成膠。

4、本發(fā)明通過引入氨基化鈦酸鋇btn和氧化結(jié)冷膠og的復(fù)合材料，提高了水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性、及耐生物降解性以及壓電性能，相比于純膠原蛋白水凝膠具有更長的使用壽命，更好的力學(xué)性能和更強(qiáng)大輸出電壓，能夠更好地滿足組織損傷治療過程中的要求。本發(fā)明提出的羅非魚膠原蛋白壓電水凝膠耐降解、高機(jī)械強(qiáng)度、收到機(jī)械刺激能夠產(chǎn)生輸出電壓、能夠調(diào)控免疫環(huán)境促進(jìn)血管再生，從而促進(jìn)組織愈合。

5、壓電水凝膠通過其內(nèi)部的壓電材料(btn)產(chǎn)生自發(fā)的電場，提供電刺激，避免了外部電源和電極的使用，從而提高了治療的便利性和患者的舒適度。該特性使得水凝膠在受損組織愈合過程中能通過超聲刺激產(chǎn)生輸出電壓，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和粘附。col/og/btn水凝膠不僅具有良好的生物相容性，還能通過超聲刺激誘導(dǎo)m1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閙2型巨噬細(xì)胞，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。這一機(jī)制有助于減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。col/og/btn水凝膠在超聲刺激后，能夠產(chǎn)生壓電，刺激巨噬細(xì)胞，讓巨噬細(xì)胞分泌生長因子vegf，促進(jìn)血管的形成，避免了生長因子的直接使用存在高成本、應(yīng)用周期短以及局部濃度難以控制等問題。

6、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種羅非魚膠原蛋白壓電水凝膠的制備方法，包括如下步驟：

7、s1、制備羅非魚膠原蛋白，將羅非魚膠原蛋白溶解于醋酸溶液中，得到酸性膠原蛋白溶液，將酸性膠原蛋白溶液與pbs溶液混合，ph調(diào)至中性后，得到膠原蛋白溶液col；

8、s2、結(jié)冷膠gg溶液中加入高碘酸鈉進(jìn)行氧化，得到氧化結(jié)冷膠og；

9、s3、將鈦酸鋇bto加入h2o2中攪拌，洗滌干燥，將干燥后的物質(zhì)加入乙醇溶液中，并滴加(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷回流反應(yīng)，經(jīng)洗滌干燥處理后，得到氨基化鈦酸鋇btn；

10、s4、將氧化結(jié)冷膠og溶于水制備og溶液，將步驟s1得到的膠原蛋白溶液與og溶液混合，得到col/og溶液，將步驟s3得到的btn粉末加入col/og溶液中攪拌至完全混合，og溶液的濃度為0.05-0.2g/ml，膠原蛋白溶液與og溶液的體積比為8-12:1，btn與col/og溶液的質(zhì)量體積比為0.005-0.02g/ml，得到col/og/btn壓電水凝膠；

11、或者將步驟s1得到的膠原蛋白、步驟s2得到的氧化結(jié)冷膠和步驟s3得到的氨基化鈦酸鋇溶于溶劑中常溫混合1-3天得到混合溶液，混合溶液中魚皮膠原濃度為2-20wt％，氧化結(jié)冷膠1-5wt％，氨基化鈦酸鋇1-5wt％，再將混合溶液進(jìn)行靜電紡絲，浸泡pbs中溶脹，得到col/og/btn壓電水凝膠。

12、優(yōu)選地，步驟s1中羅非魚膠原蛋白由如下步驟制備：將羅非魚魚皮洗滌，再在含有丁醇和異丙醇的混合溶液中浸泡后，然后將羅非魚魚皮轉(zhuǎn)移到醋酸溶液中攪拌過夜，直至膠原蛋白溶解，再將得到的粗膠原蛋白溶液離心去除顆粒，上清液加入nacl溶液中沉淀膠原蛋白攪拌過夜，之后將其離心液收集膠原蛋白沉淀，將沉淀的膠原蛋白再溶解于醋酸中，得到的溶液經(jīng)透析和凍干處理后，得到純膠原蛋白。

13、羅非魚是一種廣泛養(yǎng)殖的魚類，每年都有大量的魚皮被棄掉，其魚皮作為副產(chǎn)品通常成本較低，通過將魚皮轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)品(膠原蛋白)，能夠減少對新鮮資源的需求，通過合理利用魚皮，推動(dòng)可持續(xù)漁業(yè)的發(fā)展，促進(jìn)生態(tài)平衡。

14、本發(fā)明提出的羅非魚膠原蛋白直接從羅非魚的魚皮通過酸溶法提取的，而明膠是通過熱水提取動(dòng)物膠原蛋白而制成的，需要經(jīng)過水解和處理。相比于明膠而言，羅非魚膠原蛋白保留了魚類特有的膠原蛋白特性，具有較高比例的i型膠原蛋白，這種類型的膠原蛋白在皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、血管、軟骨和牙齒等組織中非常重要。羅非魚膠原蛋白制備的水凝膠具有良好的熱穩(wěn)定性和凝膠能力，能夠在較低的溫度下形成穩(wěn)定的凝膠，并在生理溫度下保持穩(wěn)定，而明膠等天然高分子在冷卻后形成凝膠，但其在加熱時(shí)會失去凝膠性，限制了其應(yīng)用。

15、本發(fā)明通過酸法提取羅非魚膠原蛋白的方法，比其他提取方法(如水提或酶提取)具有更高的提取效率?？梢栽谳^短時(shí)間內(nèi)獲得較高濃度的膠原蛋白溶液。酸法提取法在相對溫和的條件下進(jìn)行，能夠更好地保持膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性，確保其生物活性得以保留。酸法提取過程相對簡單，減少了對復(fù)雜設(shè)備和高技術(shù)的依賴，從而降低了生產(chǎn)成本。常用的酸(如醋酸、檸檬酸等)對環(huán)境影響較小，相較于某些化學(xué)溶劑更為安全，符合綠色提取的理念。該方法易于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；?，適合大規(guī)模生產(chǎn)，滿足市場需求。

16、優(yōu)選地，步驟s1中將酸性膠原蛋白溶液與pbs溶液混合，ph調(diào)至中性后，得到膠原蛋白溶液col的具體步驟為：將酸性膠原蛋白溶液與10×pbs溶液在4℃混合，酸性膠原蛋白溶液與10×pbs溶液的體積比為9:1，然后加入用naoh溶液將ph調(diào)至中性后，得到膠原蛋白溶液col，膠原蛋白溶液的濃度為3-6g/l。

17、通過本發(fā)明提出的羅非魚算法提取得到的膠原蛋白為ⅰ型膠原蛋白，具有良好的生物相容性，其btn納米粒子在膠原蛋白水凝膠中能夠良好的分散。

18、進(jìn)一步優(yōu)選，酸性膠原蛋白溶液與10×pbs溶液的體積比為8:1，膠原蛋白溶液的濃度為5g/l(5mg/ml)。

19、優(yōu)選地，步驟s2的具體步驟為：將結(jié)冷膠gg溶于去離子水中，升溫至80℃-100℃直至成為結(jié)冷膠gg溶液，結(jié)冷膠gg溶液的濃度為8-12g/l，將結(jié)冷膠gg溶液冷卻至40℃，加入高碘酸鈉，在黑暗中室溫?cái)嚢?-10小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到透析膜上，用去離子水透析4-6天，凍干得到氧化結(jié)冷膠og。

20、進(jìn)一步優(yōu)選，結(jié)冷膠gg與高碘酸鈉的摩爾比為1:0.85-1:0.95，結(jié)冷膠gg溶液的濃度為10g/l。

21、進(jìn)一步優(yōu)選，步驟s2的具體步驟為：將結(jié)冷膠gg溶于去離子水中，升溫至80℃-100℃直至成為結(jié)冷膠gg溶液，結(jié)冷膠gg溶液的濃度為10g/l，將結(jié)冷膠gg溶液冷卻至40℃，加入高碘酸鈉，在黑暗中室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到透析膜上，用去離子水透析5天，凍干得到氧化結(jié)冷膠og。

22、優(yōu)選地，步驟s3的具體步驟為：首先將鈦酸鋇bto粉末加入h2o2中，105℃下強(qiáng)力攪拌2-6h，洗滌，真空干燥，將干燥后的物質(zhì)加入乙醇溶液中，并滴加(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷75℃-85℃回流反應(yīng)16-24h，洗滌，真空干燥，得到氨基化鈦酸鋇btn。

23、btn納米顆粒對水凝膠壓電性能的增強(qiáng)作用，通過交聯(lián)與物理結(jié)構(gòu)的優(yōu)化提高其熱穩(wěn)定性、降解性及機(jī)械性能；btn增強(qiáng)水凝膠的降解穩(wěn)定性，延長其在組織損傷部位的使用時(shí)間。

24、改性的氨基化鈦酸鋇，表面具有一層(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷的涂層，厚度為1-5nm。

25、進(jìn)一步優(yōu)選，步驟s3的具體步驟為：首先將鈦酸鋇bto粉末加入h2o2中，105℃下強(qiáng)力攪拌4h，洗滌，真空干燥，將干燥后的物質(zhì)加入乙醇溶液中，并滴加(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷80℃回流反應(yīng)20h，洗滌，真空干燥，得到氨基化鈦酸鋇btn。

26、進(jìn)一步優(yōu)選，鈦酸鋇bto與h2o2的摩爾比為0.1-0.3:1，鈦酸鋇bto與乙醇溶液的質(zhì)量體積比為1:3-5g/ml，鈦酸鋇bto與(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷的質(zhì)量比為1.5-2.5:1。

27、再進(jìn)一步優(yōu)選，鈦酸鋇bto與h2o2的摩爾比為0.121:1，鈦酸鋇bto與乙醇溶液的質(zhì)量體積比為1:4g/ml，鈦酸鋇bto與(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷的質(zhì)量比為2:1。

28、優(yōu)選地，步驟s4中靜電紡絲的參數(shù)為：流速為5-100μl/min，紡絲距離為2-30cm，電壓為2-30kv，滾筒轉(zhuǎn)速為100-4000rmp，所述的溶劑為六氟異丙醇。

29、本發(fā)明提出的質(zhì)量體積比的單位為g/ml。

30、本發(fā)明還保護(hù)所述的羅非魚膠原蛋白壓電水凝膠在制備治療組織損傷的生物材料領(lǐng)域中的應(yīng)用。組織損傷包括皮膚、骨骼、肌腱、血管、軟骨、牙齒等。

31、本發(fā)明還保護(hù)一種治療傷口愈合的生物材料，以所述的羅非魚膠原蛋白壓電水凝膠為活性成分，保留了膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。

32、本發(fā)明提出的羅非魚膠原蛋白水凝膠的壓電特性，使得該水凝膠能夠在外力作用下自發(fā)地產(chǎn)生電場，避免了外部電源的依賴。這一特性有助于促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、血管生成，并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，加速受損組織再生愈合。

33、本發(fā)明提出的col/og/btn壓電水凝膠能夠有效調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)m1型巨噬細(xì)胞向m2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。m2型巨噬細(xì)胞具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠減少組織損傷部位的炎癥反應(yīng)，為組織修復(fù)和再生創(chuàng)造有利環(huán)境。此外，m2型巨噬細(xì)胞還促進(jìn)血管生成，這對于組織再生至關(guān)重要。

34、本發(fā)明提出的水凝膠在超聲下能夠壓電刺激促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌生長因子vegf，提高抗炎基因cd206，降低促炎基因cd86和inos的表達(dá)。與此同時(shí)，釋放的vegf促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)中關(guān)于b-fgf,ang-1的mrna表達(dá)，表明該壓電水凝膠對組織損傷再生的巨大潛力。

35、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

36、1、本發(fā)明利用羅非魚膠原蛋白這一海洋資源作為原料，不僅為海洋資源的可持續(xù)利用提供了新的思路，還使得這種水凝膠具備良好的生物相容性和安全性。膠原蛋白作為天然高分子材料，具有優(yōu)異的細(xì)胞親和性和生物降解性，有助于促進(jìn)組織再生和傷口愈合。羅非魚膠原蛋白不僅來源豐富，且具有與人體膠原蛋白相似的氨基酸序列，具有良好的生物相容性，能夠有效促進(jìn)細(xì)胞附著和生長。這使得其成為理想的組織工程材料。

37、2、本發(fā)明提出的btn表面有氨基可以與og上的醛基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，增加交聯(lián)密度，此外，納米粒子的加入本身具有增強(qiáng)作用，使水凝膠的抗壓強(qiáng)度增加，并且不會影響鈦酸鋇自身的壓電性能。

38、3、本發(fā)明通過引入胺化鈦酸鋇(btn)和氧化結(jié)冷膠(og)，使合成的壓電水凝膠具有顯著改善的物理性能，。btn能夠增強(qiáng)水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和壓電性能，降低水凝膠的生物降解速率和溶脹性，使其在生理?xiàng)l件下更具穩(wěn)定性，延長了其使用壽命。與純羅非魚膠原蛋白水凝膠相比，col/og/btn復(fù)合水凝膠在力學(xué)性能上表現(xiàn)出明顯的提升，這對于需要承受一定拉伸力和剪切力的傷口愈合環(huán)境尤為重要。

39、4、本發(fā)明通過壓電材料(btn)的引入，使水凝膠能夠自發(fā)地產(chǎn)生電能。這一特性避免了傳統(tǒng)電刺激裝置對外部電源和電極的依賴，簡化了治療設(shè)備，減少了患者的不適感和治療成本。壓電水凝膠通過自發(fā)電場作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境和血管生成，不僅減少了設(shè)備的復(fù)雜性，還提高了患者的治療體驗(yàn)。

40、5、本發(fā)明提出的col/og/btn壓電水凝膠能夠有效調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)m1型巨噬細(xì)胞向m2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。m2型巨噬細(xì)胞具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠減少創(chuàng)傷部位的炎癥反應(yīng)，為受損組織修復(fù)和再生創(chuàng)造有利環(huán)境。此外，m2型巨噬細(xì)胞還促進(jìn)血管生成，這對于傷口愈合至關(guān)重要。