本發(fā)明屬于有機合成領(lǐng)域，具體涉及一種殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物及其合成方法和作為核酸載體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來，基于核酸的基因治療技術(shù)發(fā)展迅速，其通過傳遞基因藥物，替換缺陷基因、替代缺失基因或沉默不需要的基因表達，達到治療許多遺傳性、癌癥或病毒性疾病的效果。然而，要將核酸藥物安全高效地遞送至靶細胞并發(fā)揮功能，需要克服如核酸酶的降解、半衰期短、血液循環(huán)中的免疫細胞識別、靶組織的積累、跨膜轉(zhuǎn)運以及從內(nèi)涵體和溶酶體逃逸等問題。因此，構(gòu)建合適的核酸藥物載體是基因治療成功的關(guān)鍵。

2、聚合物納米載體可以通過吸附、共價結(jié)合、交聯(lián)和包埋等方式結(jié)合藥物，運輸?shù)襟w內(nèi)病變部位，其化學(xué)組成、分子量、多分散系數(shù)等物理化學(xué)性質(zhì)可以根據(jù)遞送核酸類藥物的種類而設(shè)計。大多數(shù)聚合物納米載體的共同特點是結(jié)合了陽離子基團，可促進與核酸的靜電結(jié)合，還可以通過使用可降解的連接物實現(xiàn)核酸與聚合物的共價連接。

3、聚乙烯亞胺(pei)是運用較為廣泛的陽離子多聚體載體材料，也是目前的研究熱點。高分子量pei帶有更多的氨基，質(zhì)子化后有更多正電荷，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但同時也有較高的細胞毒性，不適于臨床上的應(yīng)用。而低分子量的pei在較為寬松的環(huán)境下表現(xiàn)出穩(wěn)定運輸核酸和低細胞毒性的性能，但是其轉(zhuǎn)染率十分低下，缺乏實際使用意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為：提供一種殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物及其制備方法和作為高效、低毒核酸載體的應(yīng)用。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物，其結(jié)構(gòu)式如下：

3、

4、其中，40<m<50，10<m1<20，10<m2<20，100<n<370。

5、上述所述的殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物的制備方法，包括下述步驟：

6、①將甲氧基聚乙二醇與碘甲烷反應(yīng)得到甲氧基聚乙二醇碘；

7、②將步驟①所述甲氧基聚乙二醇碘與聚乙烯亞胺反應(yīng)得到甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物；

8、③將殼聚糖與四氯鄰苯二甲酸酐反應(yīng)得到四氯鄰苯二甲酰殼聚糖；

9、④將步驟③所述四氯鄰苯二甲酰殼聚糖與碘反應(yīng)得到四氯鄰苯二甲酰殼聚糖碘；

10、⑤將步驟④所述四氯鄰苯二甲酰殼聚糖碘溶于堿性溶液中，加入步驟②所述甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺溶液，在保護氣體氛圍下攪拌反應(yīng)，得到四氯鄰苯二甲酰殼聚糖甲氧基聚乙二醇聚乙烯亞胺；

11、⑥將步驟⑤所述四氯鄰苯二甲酰殼聚糖甲氧基聚乙二醇聚乙烯亞胺溶解于乙醇中，加入乙二胺，在保護氣體氛圍下攪拌反應(yīng)，得到殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物。

12、進一步地，所述步驟①的反應(yīng)步驟具體為：

13、將甲氧基聚乙二醇和亞磷酸三苯酯在80℃下攪拌溶解，反應(yīng)1h，加入碘甲烷，保護氣體氛圍下120℃反應(yīng)6～8h，加入甲苯，反應(yīng)液傾入冰異丙醚中，攪拌析出沉淀，分離并洗滌沉淀，將得到的固體在25-35℃下干燥過夜，即得甲氧基聚乙二醇碘。

14、優(yōu)選地，所述甲氧基聚乙二醇、碘甲烷與亞磷酸三苯酯的摩爾比為1：4.5：3，所述保護氣體為氮氣。

15、進一步地，所述步驟②的反應(yīng)步驟具體為：

16、將步驟①所述甲氧基聚乙二醇碘溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入溶于n，n-二甲基甲酰胺中的聚乙烯亞胺，加熱至70-80℃，保護氣體氛圍下攪拌反應(yīng)8h，將反應(yīng)液濃縮即得甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物溶液。

17、優(yōu)選地，所述甲氧基聚乙二醇碘與聚乙烯亞胺的摩爾比為2：1，所述保護氣體為氮氣。

18、進一步地，所述步驟③的反應(yīng)步驟具體為：

19、將殼聚糖、水、n，n-二甲基甲酰胺混合均勻，加入四氯鄰苯二甲酸酐，加熱至120-130℃，保護氣體氛圍下攪拌反應(yīng)7小時，將反應(yīng)液傾入冰水中，攪拌析出固體，分離并洗滌沉淀，靜置過夜；

20、將固體濾出，加入無水乙醇，加熱至78-80℃，回流1h，趁熱過濾，所得濾餅在55℃下干燥4h-6h，即得四氯鄰苯二甲酰殼聚糖。

21、優(yōu)選地，所述其中所述殼聚糖單元與四氯鄰苯二甲酸酐的摩爾比為1：3，所述保護氣體為氮氣。

22、進一步地，所述步驟④的反應(yīng)步驟具體為：

23、將n，n-二甲基甲酰胺、三苯基磷、碘混合，加入咪唑，再加入步驟③所述四氯鄰苯二甲酰殼聚糖，將反應(yīng)液加熱至70-80℃，保護氣體氛圍下攪拌反應(yīng)24h；

24、將反應(yīng)液加入冰甲醇中，攪拌析出固體，分離并洗滌固體，將固體于55℃鼓風(fēng)干燥4小時，得四氯鄰苯二甲酰殼聚糖碘。

25、優(yōu)選地，所述殼聚糖單元、碘、咪唑和三苯基膦的摩爾比為1：6：18：7，所述保護氣體為氮氣。

26、進一步地，所述步驟⑤的反應(yīng)步驟具體為：

27、將步驟④所述四氯鄰苯二甲酰殼聚糖碘溶于n，n-二甲基甲酰胺，加熱至55℃，保護氣體氛圍下攪拌1小時，加入步驟②所述甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物溶液，將反應(yīng)液加熱至70-80℃，保護氣體氛圍下攪拌反應(yīng)24h；

28、將反應(yīng)液過濾，在截留分子量為30kda的條件下，加入注射用水透析72h，即得四氯鄰苯二甲酰殼聚糖甲氧基聚乙二醇聚乙烯亞胺。

29、優(yōu)選地，所述四氯鄰苯二甲酰殼聚糖碘單元與甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺的摩爾比為1：1.4，所述保護氣體為氮氣。

30、進一步地，所述步驟⑥的反應(yīng)步驟具體為：

31、將步驟⑤所述四氯鄰苯二甲酰殼聚糖甲氧基聚乙二醇聚乙烯亞胺與無水乙醇混合，加入乙二胺，加熱至90℃，保護氣體氛圍下攪拌反應(yīng)24h；

32、將反應(yīng)液過濾，濃縮除去乙醇，在截留分子量為100kda的條件下，加入注射用水透析72h，即得殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物。

33、優(yōu)選地，所述四氯鄰苯二甲酰殼聚糖甲氧基聚乙二醇聚乙烯亞胺單元與乙二胺的摩爾比為1：4.5，所述保護氣體為氮氣。

34、進一步地，所述殼聚糖的分子量為50000～60000，所述甲氧基聚乙二醇為mpeg2000，所述聚乙烯亞胺為pei?1800。

35、上述所述的殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物在制備核酸載體上的用途。

36、進一步地，所述制備核酸載體的方法為：

37、a、將殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物溶解在醋酸水溶液中并通過0.45μm微孔濾膜過濾，在65℃水浴恒溫5～10min；

38、b、將含三聚磷酸鹽的核酸溶液在65℃水浴恒溫5～10min；

39、c、將a處理后的溶液與b處理后的溶液均勻混合，靜置5～10min，即得殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺核酸納米粒子。

40、進一步地，所述殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物與核酸的質(zhì)量比為60～100。優(yōu)選地，所述殼聚糖-甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亞胺聚合物與核酸的質(zhì)量比為80。

41、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

42、1、本發(fā)明引入親水基團甲氧基聚乙二醇和天然高分子材料殼聚糖，甲氧基聚乙二醇能提高載體與核酸復(fù)合物的水溶性和穩(wěn)定性，還能屏蔽部分陽離子聚合物的電荷，在減小細胞毒性的同時提高轉(zhuǎn)染效率。殼聚糖可被生物降解，生物相容性好，能夠改善載體的生物相容性作用。

43、2、本發(fā)明制備的聚合物載體結(jié)構(gòu)簡單，材料便宜易得，易于合成。