本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種高效表達(dá)豬鏈球菌光譜抗原gdh的方法。

背景技術(shù)：

1、豬鏈球菌( streptococcus?suis， s.suis)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，可致豬腦膜炎、肺炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及突然死亡等病癥；也可以通過(guò)受損的皮膚或粘膜感染人類，是一種重要的人獸共患傳染病病原。豬鏈球菌病是一種常見(jiàn)的豬傳染病，是由鏈球菌屬中多種鏈球菌引致的豬的一種傳染性疫病的總稱。根據(jù)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》及其有關(guān)規(guī)定，該病為二類動(dòng)物疫病。臨床上主要特征表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、皮膚化膿性感染和淋巴結(jié)膿腫等，其中以敗血癥、關(guān)節(jié)炎的危害最大，在某些特定誘因作用下，發(fā)病豬群的死亡率可以達(dá)到80%，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害極大。

2、豬鏈球菌是危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的一種重要人獸共患病病原，該菌血清型多，且不同血清型之間無(wú)交叉保護(hù)力，常常與其他疾病合并感染，發(fā)病率和死亡率較高。不同血清型菌株致病性的差異與菌株毒力因子密切相關(guān)；其中，毒力因子谷氨酸脫氫酶（gdh）是不同血清型菌株共有且具有較好的免疫原性；gdh可作為診斷抗原準(zhǔn)確檢測(cè)豬鏈球菌的感染。重組 e.? coli表達(dá)的gdh具有較好的免疫原性，其制備的抗體可與野生型菌株中相應(yīng)分子量的蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，且保護(hù)率達(dá)75%以上，則gdh可作為豬鏈球菌基因工程亞單位疫苗的候選抗原。

3、目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于豬鏈球菌光譜抗原gdh表達(dá)的研究較多，如山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院已構(gòu)建得到gdh的表達(dá)菌株e.?coli?ss2-gdh，但其需iptg誘導(dǎo)及添加抗生素，且乙酸積累量高、gdh表達(dá)水平低。因此，基于gdh表達(dá)誘導(dǎo)機(jī)制、發(fā)酵過(guò)程控制優(yōu)化以及gdh免疫原性分析，通過(guò)宿主菌基因改造及發(fā)酵參數(shù)控制水平優(yōu)化降低乙酸積累，實(shí)現(xiàn)gdh高效表達(dá)是推動(dòng)工業(yè)化生產(chǎn)gdh的關(guān)鍵，目前仍缺少上述相關(guān)的研究和報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種高效表達(dá)豬鏈球菌光譜抗原gdp的方法，基于重組蛋白高效表達(dá)機(jī)制分析與乙酸合成機(jī)制分析，對(duì)宿主菌的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與乙酸合成途徑進(jìn)行改造，并對(duì)培養(yǎng)基組分、發(fā)酵過(guò)程參數(shù)控制進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)gdh蛋白的高效表達(dá)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種高效表達(dá)豬鏈球菌光譜抗原gdp的方法，具體包括如下步驟：

3、（1）缺失菌株構(gòu)建：以表達(dá)gdh菌株ssg為出發(fā)菌株，按照利用red同源重組敲除基因的方法，構(gòu)建pta（ssgp）、acka（ssga）以及pta-acka（ssgpa）缺失菌株，分別以鑒定引物pta-p3-pta-p4、acka-p3-acka-p4擴(kuò)增缺失菌株；通過(guò)篩選試驗(yàn)確定最佳缺失菌株；

4、（2）發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：按照種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組分準(zhǔn)確配制發(fā)酵培養(yǎng)基；

5、（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將三角瓶中的種子培養(yǎng)液按5%的接種量接種至裝有5?l發(fā)酵培養(yǎng)基的10?l發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度控制在37℃；控制發(fā)酵ph和溶氧，并進(jìn)行補(bǔ)料；當(dāng)培養(yǎng)10?h時(shí)，添加iptg誘導(dǎo)gdh蛋白表達(dá)，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)20h；

6、（4）gdh蛋白純化：將發(fā)酵液中的gdh蛋白進(jìn)行純化，即得豬鏈球菌光譜抗原gdh。

7、進(jìn)一步的，所述ssg菌株為山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院篩選菌株 e.?coli?ss2-gdh， e.?coli?bl21含有 gdha基因。

8、進(jìn)一步的，所述利用red同源重組敲除基因的方法包括如下步驟：

9、（1）帶有擬敲除基因同源臂氯霉素抗性基因片段的擴(kuò)增與克隆:以待敲除的基因序列作為模板設(shè)計(jì)引物5’-端的56?bp同源臂序列，以質(zhì)粒pkd3為模板設(shè)計(jì)氯霉素抗性基因的擴(kuò)增引物，使用該引物對(duì)氯霉素抗性基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增；pcr產(chǎn)物連接pmd19-t，轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，氯霉素抗性平板挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)接液體過(guò)夜培養(yǎng)提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳，并酶切驗(yàn)證；所得質(zhì)粒送測(cè)序，序列比對(duì)；雙酶切質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收約1200?bp的片段;

10、(2)氯霉素抗性基因替換擬敲除的目的基因:把上述步驟得到的1200?bp片段電擊轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)有pkd46的受體菌中，進(jìn)行red同源重組，氯霉素抗性平板篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接平板純培養(yǎng)后進(jìn)行菌落pcr，篩選得含氯霉素抗性基因的重組菌;

11、(3)重組子的鑒定：重組子菌落pcr產(chǎn)物連接t-vector，轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，氯霉素抗性平板挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)接液體過(guò)夜培養(yǎng)提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳，并酶切驗(yàn)證；所得質(zhì)粒送測(cè)序，序列比對(duì)；

12、（4）抗性基因的消除：把pcp20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上一步操作得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇后，涂布與含有氨芐青霉素的抗性平板；使用鑒定引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，對(duì)得到正確擴(kuò)增條帶的菌株的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)高溫（42℃）培養(yǎng)消除質(zhì)粒pcp20，完成整個(gè)基因敲除過(guò)程。

13、進(jìn)一步的，所述缺陷菌株ssgg來(lái)源于ssg，ptsg缺失；缺陷菌株ssggfk來(lái)源于ssgg，含有pstv-fk質(zhì)粒；缺陷菌株ssggpk來(lái)源于ssgg，含有pstv-pk質(zhì)粒。

14、進(jìn)一步的，所述質(zhì)粒pstv-fk和pstv-pk的構(gòu)建方法包括如下步驟：

15、（1）目的片段的pcr擴(kuò)增：利用pcr技術(shù)，以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 e.?coli?k12?mg1655的基因組為模板，利用引物 glk-p1和 glk-p2擴(kuò)增 glk e.?coali基因；利用引物 galp-p1和 galp-p2擴(kuò)增 galp e.?coli基因；以 z.?mobilis菌株的基因組為模板，利用引物 glf-p1和 glf-p2擴(kuò)增 gfl z.?mobilis基因，擴(kuò)增產(chǎn)物利用dna純化試劑盒進(jìn)行回收；

16、（2）質(zhì)粒pstv-k的構(gòu)建：以質(zhì)粒pstv28為載體，利用限制性內(nèi)切酶 sac?i和 pst?i分別對(duì)pstv28質(zhì)粒和目的基因 glk e.?coali的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切處理，隨后利用t4?dna連接酶將線性化的pstv28載體和經(jīng)過(guò)雙酶切處理的 glk e.?coali基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，獲得pstv-k質(zhì)粒；

17、（3）質(zhì)粒pstv-fk和pstv-pk的構(gòu)建：以質(zhì)粒pstv-k為載體，利用限制性內(nèi)切酶 sac?i和 pst?i分別對(duì)pstv-k質(zhì)粒和目的基因 gfl z.?mobilis、 galp e.?coli的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切處理，隨后利用t4?dna連接酶分別將目的基因 gfl z.?mobilis和 galp e.?coli與線性化的pstv28載體進(jìn)行連接，構(gòu)建得到pstv-fk和pstv-pk質(zhì)粒。

18、進(jìn)一步的，所述引物 galp-p1的dna序列為5’-tgcactgcagcggtcaaacaaggcaatg-3’b?( psti)；所述引物 galp-p2的dna序列為5’-acatgcatgcatagcggcagaggatagagc-3’b?；所述引物 glf-p1的dna序列為5’-tgcactgcagccgatactcggcgattgtaag-3’b?(psti)；所述引物 glf-p2的dna序列為5’-acatgcatgcaaggattcagccaaagcaagt-3’b?(sphi)。

19、優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基為：酵母粉?5?g/l，蛋白胨?10?g/l，nacl?10?g/l。

20、優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)為：葡萄糖?5.0?g/l、酵母粉?5.0?g/l、蛋白胨?2.0?g/l、檸檬酸?1.5?g/l、kcl?2.0?g/l、mgso4?7h2o?1.5?g/l、(nh4)2so4?2.0?g/l、氯化膽堿?1.0?ml/l、vb1?20.0?mg/l、vh?5.0?mg/l。

21、最優(yōu)的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：：葡萄糖?5.0?g/l、酵母粉?5.0?g/l、蛋白胨?2.0?g/l、檸檬酸?1.5?g/l、kcl?2.0?g/l、mgso4?7h2o?1.5?g/l、(nh4)2so4?2.0?g/l、氯化膽堿?1.0ml/l、vb1?20.0?mg/l、vh?5.0?mg/l、三甲基甘氨酸2.0?g/l。

22、優(yōu)選的，發(fā)酵過(guò)程中所述ph水平控制策略為為：0~10?h控制在7.0，10~20?h控制在6.5；

23、優(yōu)選的，發(fā)酵過(guò)程中所述溶氧水平控制在0~10?h控制在60%，10~20?h控制在30%。

24、優(yōu)選的，所述補(bǔ)料方式為：根據(jù)溶氧電極檢測(cè)的溶氧信號(hào)補(bǔ)加葡萄糖溶液，當(dāng)溶氧值突然升高時(shí)，通過(guò)脈沖補(bǔ)料補(bǔ)加葡萄糖溶液10次，如此反復(fù)補(bǔ)加。

25、進(jìn)一步的，所述iptg的濃度為0.5?mmol/l。

26、進(jìn)一步的，所述?gdh蛋白的純化包括如下步驟：

27、（1）取誘導(dǎo)表達(dá)后培養(yǎng)液，收集菌體，每100?mg菌體（濕重）加入1~5?ml細(xì)菌裂解液（每1?ml?細(xì)菌抽提試劑中已加入10? μl?pmsf），超聲裂解菌體；

28、（2）10000?rpm，4℃離心3分鐘，收集上清中的可溶性蛋白；

29、（3）用binding?buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液；

30、（4）使用15倍柱體積的binding?buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白；

31、（5）使用elution?buffer洗脫，收集洗脫峰；

32、（6）洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒(méi)），4℃保存。

33、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

34、（1）本發(fā)明基于豬鏈球菌gdh蛋白表達(dá)a存在的關(guān)鍵難題，結(jié)合代謝工程原理與蛋白高效表達(dá)理論，通過(guò)乙酸合成途徑改造、培養(yǎng)基組分篩選、發(fā)酵過(guò)程參數(shù)調(diào)控以及免疫原性研究等，實(shí)現(xiàn)了具有良好免疫原性豬鏈球菌gdh蛋白的高效表達(dá)；結(jié)合不同重組菌株表達(dá)gdh蛋白的過(guò)程分析，得到利于gdh蛋白高效表達(dá)的重組菌株ssgpa，與出發(fā)菌株相比，乙酸積累量降低了18.40%，細(xì)胞濃度和gdh表達(dá)水平分別提高了62.61%、76.19%；

35、（2）本發(fā)明在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性的添加三甲基甘氨酸，并確定三甲基甘氨酸添加濃度為2.0?g/l。采用該培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞濃度與gdh表達(dá)水平分別為39.47（od600）、2.98?g/l；

36、（3）本發(fā)明基于ph與溶氧水平對(duì)gdh蛋白表達(dá)的影響，得到gdh蛋白高效表達(dá)的ph與溶氧分階段控制策略；結(jié)合應(yīng)用不同補(bǔ)料策略進(jìn)行g(shù)dh蛋白表達(dá)的結(jié)果，確定采用溶氧反饋控制補(bǔ)料策略表達(dá)gdh蛋白。利用該工藝，在50l發(fā)酵罐上表達(dá)gdh蛋白時(shí)，細(xì)胞濃度與gdh蛋白表達(dá)水平分別提高至48.47（od600）、4.13?g/l，實(shí)現(xiàn)了gdh蛋白的高效表達(dá)；

37、（4）本發(fā)明高效表達(dá)gdh蛋白以可溶性表達(dá)為主，且具有良好的免疫原性。通過(guò)動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)得知，高效表達(dá)的gdh蛋白的以采用蜂膠作為佐劑，其免疫保護(hù)率為70%，則表明高效表達(dá)的gdh蛋白可作為豬鏈球菌亞單位疫苗的有效抗原成分；

38、（5）本發(fā)明在500?l發(fā)酵罐上，應(yīng)用ph值及溶氧分階段控制策略，結(jié)合溶氧反饋控制補(bǔ)料策略，乙酸積累量降低至2.48?g/l，細(xì)胞濃度為48.47（od600），?gdh蛋白表達(dá)水平為4.13?g/l，實(shí)現(xiàn)了gdh蛋白的高效表達(dá)的工業(yè)化生產(chǎn)。