本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種多潛能干細(xì)胞擬胚體分化方法及其培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)是具備自我更新能力多性的特殊細(xì)胞。它們擁有向外、中、內(nèi)三個(gè)胚層分化的卓越潛能，能夠分化出多種人體所有類型的細(xì)胞。中胚層來源的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，在治療外周血管疾病以及在骨和軟骨修復(fù)方面也有巨大潛力。來源于造血系統(tǒng)的分化也被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞治療領(lǐng)域，通過其分化的不同類型的細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞、紅細(xì)胞祖細(xì)胞、血小板、t淋巴細(xì)胞等具有多種不同應(yīng)用前景，有望為疾病臨床的治療帶來深遠(yuǎn)的影響。

2、中胚層細(xì)胞是通過ipsc分化為擬胚體(eb)，再經(jīng)過進(jìn)一步分化得到。多潛能干細(xì)胞在形成eb的過程中需要添加某些成分抵抗細(xì)胞凋亡，常規(guī)會(huì)短暫添加atp競(jìng)爭(zhēng)性的rock通路抑制劑y-27632來幫助擬胚體形成。但是因?yàn)槎嗄芨杉?xì)胞株間的異質(zhì)性，使用y-27632難以滿足所有細(xì)胞的要求。而長(zhǎng)時(shí)間添加y-27632會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞向非預(yù)期方向分化，影響目的細(xì)胞的制備效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供chroman?1和emricasan在人多潛能干細(xì)胞制備擬胚體中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了chroman?1和emricasan在人多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為擬胚體中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明提供了一種用于人多潛能干細(xì)胞分化為擬胚體的培養(yǎng)基，包括第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；

4、所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是以ipsc培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，還包括以下含量組分：5～50μmy-27632、5～50μm?chir-99021、10～100nm?chroman?1和2～20μmemricasan；

5、所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是以imdm培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，還包括以下含量組分：10～100ng/mlbmp-4、10～100ng/mlvegf-165、10～100ng/ml?fgf、chroman?10～100nm和emricasan?0～20μm；

6、所述第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是以imdm培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，還包括以下含量組分：

7、10～100ng/ml?bmp-4、10～100ng/mlvegf-165、10～100ng/mlfgf、2～10μmsb431542、0～100nm?chroman?1和0～20μm?emricasan。

8、優(yōu)選的，所述ipsc培養(yǎng)基包括含體積百分比5％aof?supplement的aof培養(yǎng)基。

9、優(yōu)選的，所述imdm培養(yǎng)基包括以下體積百分比的組分：2％b27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、1％glutamax、1％neaa細(xì)胞培養(yǎng)添加物、1％pen?strep抗生素混合物、50μg/ml維生素c、0.1mm硫代甘油和30μm?n-乙酰半胱氨酸。

10、本發(fā)明提供了所述培養(yǎng)基在人多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為擬胚體中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明提供了一種人多潛能干細(xì)胞擬胚體的誘導(dǎo)分化方法，包括以下步驟：

12、將人多潛能干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液接種于上述技術(shù)方案中第一誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行第0天誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，得到擬胚體；

13、將所述擬胚體接種于上述技術(shù)方案中第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行第1天誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，得到第一分化細(xì)胞；

14、將所述第一分化細(xì)胞接種于上述技術(shù)方案中第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)行第2～4天誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，收集擬胚體。

15、優(yōu)選的，人多潛能干細(xì)胞的單細(xì)胞的制備方法，將培養(yǎng)至80％匯合度的人多潛能干細(xì)胞采用accutase胚胎消化液消化2min，棄去accutase胚胎消化液，繼續(xù)消化3min，得到人多潛能干細(xì)胞的單細(xì)胞。

16、優(yōu)選的，所述人多潛能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括將人多潛能干細(xì)胞接種于包被有l(wèi)aminin521的細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)和傳代，期間每天更換新鮮的ipsc培養(yǎng)基。

17、優(yōu)選的，所述laminin521的包被濃度為2.5～5％；

18、所述laminin521的包被溶劑為dpbs(含鈣離子和鎂離子)。

19、本發(fā)明提供了所述誘導(dǎo)分化方法在制備人多潛能干細(xì)胞分化為中胚層的應(yīng)用。

20、本發(fā)明提供了一種用于人多潛能干細(xì)胞分化為擬胚體的培養(yǎng)基，包括第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；所述第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是以ipsc培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，還包括以下含量組分：5～50μmy-27632、5～50μm?chir-99021、10～100nm?chroman?1和2～20μm?emricasan；所述第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是以imdm培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，還包括以下含量組分：10～100ng/ml?bmp-4、10～100ng/ml?vegf-165、10～100ng/mlfgf、chroman?10～100nm和emricasan?0～20μm；所述第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是以imdm培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，還包括以下含量組分：10～100ng/ml?bmp-4、10～100ng/mlvegf-165、10～100ng/ml?fgf、2～10μm?sb431542、0～100nm?chroman?1和0～20μm?emricasan。本發(fā)明通過引入兩個(gè)信號(hào)通路的抑制劑chroman?1和emricasan促進(jìn)人多潛能干細(xì)胞向擬胚體分化，從而使得更多的細(xì)胞能夠在制備與分化過程中保持良好的狀態(tài)，從而顯著提高了分化接種過程中細(xì)胞的存活率。同時(shí)，在分化到中胚層細(xì)胞的最終得率上，該技術(shù)路線比原有方案有顯著的提升。

21、本發(fā)明還提供了一種人多潛能干細(xì)胞擬胚體的誘導(dǎo)分化方法，與傳統(tǒng)的懸滴法、微孔板法和離心法的eb制備方法相比，該方法更為簡(jiǎn)單，易于工藝放大，可用于大批量生產(chǎn)目的細(xì)胞。在這個(gè)過程中所涉及的物料可做到無外源因子，無血清，有效的避免了動(dòng)物源性病原體帶來的風(fēng)險(xiǎn)，提高了臨床應(yīng)用的安全性。

技術(shù)特征：

1.chroman?1和emricasan在人多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為擬胚體中的應(yīng)用。

2.一種用于人多潛能干細(xì)胞分化為擬胚體的培養(yǎng)基，其特征在于，包括第一誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、第二誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和第三誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述ipsc培養(yǎng)基包括含體積百分比5％aofsupplement的aof培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述imdm培養(yǎng)基包括以下體積百分比的組分：2％b27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、1％glutamax、1％neaa細(xì)胞培養(yǎng)添加物、1％pen?strep抗生素混合物、5μg/ml維生素c、0.1mm硫代甘油和30um?n-乙酰半胱氨酸。

5.權(quán)利要求2～4任意一項(xiàng)所述培養(yǎng)基在人多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為擬胚體中的應(yīng)用。

6.一種人多潛能干細(xì)胞擬胚體的誘導(dǎo)分化方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述誘導(dǎo)分化方法，其特征在于，人多潛能干細(xì)胞的單細(xì)胞的制備方法，將培養(yǎng)至80％匯合度的人多潛能干細(xì)胞采用accutase胚胎消化液消化2min，棄去accutase胚胎消化液，繼續(xù)消化3min，得到人多潛能干細(xì)胞的單細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述誘導(dǎo)分化方法，其特征在于，所述人多潛能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括將人多潛能干細(xì)胞接種于包被有l(wèi)aminin521的細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)和傳代，期間每天更換新鮮的ipsc培養(yǎng)基。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述誘導(dǎo)分化方法，其特征在于，所述laminin521的包被質(zhì)量濃度為2.5％～5％；

10.權(quán)利要求6～9中任意一項(xiàng)所述誘導(dǎo)分化方法在制備人多潛能干細(xì)胞分化為中胚層的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種多潛能干細(xì)胞擬胚體分化方法及其培養(yǎng)基，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加兩個(gè)信號(hào)通路的抑制劑(Chroman?1和Emricasan)能促進(jìn)多潛能干細(xì)胞向擬胚體(EB)分化，使細(xì)胞能夠在制備與分化過程中保持良好的狀態(tài)，從而提高細(xì)胞存活率。與傳統(tǒng)的懸滴法、微孔板法和離心法制備EB相比，本發(fā)明提供的多潛能干細(xì)胞擬胚體分化方法，更為簡(jiǎn)單，易于工藝放大，且整個(gè)過程中不涉及外源因子和血清，保證了臨床應(yīng)用安全性的同時(shí)還可大批量生產(chǎn)目的細(xì)胞，為臨床應(yīng)用多潛能干細(xì)胞擬胚體及其中胚層細(xì)胞提供良好技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：劉乙齊,鄭雅茹,尹遠(yuǎn)昊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京北啟生物醫(yī)藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15