背景技術(shù)：

1、分枝是植物中一個復(fù)雜的生物過程，不僅受遺傳、環(huán)境、激素和營養(yǎng)等多種因素的調(diào)節(jié)，還與植物的頂端優(yōu)勢和植被覆蓋率密切相關(guān)。頂端優(yōu)勢的抑制可以促進植物分枝，從而增加植被覆蓋率。例如，在豆科植物蘇丹麻中，通過去除頂端優(yōu)勢可以增加分枝數(shù)量，從而提高植被覆蓋率，抑制雜草生長。除了分枝發(fā)育，植物的株高也是一個重要的形態(tài)特征，同樣受到遺傳和環(huán)境因素的調(diào)控。植物株高的調(diào)控機制與分枝發(fā)育存在一定的關(guān)聯(lián)。例如，通過調(diào)控植物的頂端優(yōu)勢，也可以影響植株的垂直生長，從而調(diào)節(jié)植物的整體株高。此外，分枝發(fā)育還會影響植物的莖生物量、生長速率和木結(jié)形成，在森林形態(tài)中起著重要作用。

2、許多關(guān)于分枝的研究都集中在草本植物上，如擬南芥、水稻和飼料植物。近年來，植物的分枝發(fā)育成為了育種家們研究的新熱點，研究對象從模式植物擬南芥、水稻逐步開始向其他植物拓展。擬南芥的cyp735a、水稻的osckx4、柳枝稷的pvlbo、番茄的sld14、蘋果的mdipt1和楊樹的ppebb1-oe等，這些基因?qū)χ参锓种Πl(fā)育起重要調(diào)控作用。分枝發(fā)育與株高的調(diào)控對于作物和林木的生產(chǎn)都很重要。增加分枝有利于提高作物產(chǎn)量，合理的株高有利于提高植被覆蓋率、光合效率和機械收獲效率。綜上所述，通過調(diào)控植物的分枝調(diào)控基因，特別是通過調(diào)控植物的頂端優(yōu)勢，可以促進分枝發(fā)育，并同時影響植株的株高，從而實現(xiàn)對植物整體形態(tài)的優(yōu)化并增加植被覆蓋率和作物產(chǎn)量。這對于作物和林木的生產(chǎn)都有重要的應(yīng)用價值。

3、鑒于此，本發(fā)明在國內(nèi)外現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，針對缺乏關(guān)于fz1基因參與調(diào)控分枝及株高發(fā)育研究的問題，對調(diào)控分枝及株高發(fā)育的fz1基因進行功能鑒定，借用分子手段將其應(yīng)用到作物或樹木的改良，對于提高植被覆蓋率和林木生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一種調(diào)控植物分枝發(fā)育及株高表型的蛋白fz1及其編碼基因。

2、本發(fā)明最主要的目的是提供上述蛋白fz1及其編碼基因在調(diào)控木本植物分枝及株高表型中的應(yīng)用。

3、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

4、在研究過程中從植物中發(fā)現(xiàn)了一個新的調(diào)控分枝及株高表型的蛋白，命名為fz1蛋白，將編碼fz1蛋白的基因命名為fz1基因。該基因cds序列如序列表的seq?id?no.1所示。該蛋白為如下(1)或(2)或(3)：

5、(1)由序列表中seq?id?no.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

6、(2)由序列表中seq?id?no.2所示的氨基酸序列的末端添加標(biāo)簽序列組成的蛋白質(zhì)；

7、(3)將序列表中seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白質(zhì)。

8、本發(fā)明主要保護上述fz1蛋白或所述的fz1蛋白的編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在負調(diào)控植物分枝及株高表型的應(yīng)用，其中，所述生物材料可以為表達盒、載體、宿主細胞或重組菌。

9、更加具體地，所述負調(diào)控植物分枝及株高表型具體表現(xiàn)為：與野生型相比，基因編輯植株矮小且分枝增多。

10、另外，除了上述上述調(diào)控植物分枝及株高表型之外，還對其他的表型及生理指標(biāo)以及激素組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的聯(lián)合分析，還有激素代謝相關(guān)差異基因的表達情況、植物形成層發(fā)育和木材積累的檢測等方面的研究，得出，降低fz1蛋白或抑制所述的fz1蛋白的編碼基因的表達還有以下任一方面的功能：(1)抑制光合作用；

11、(2)抑制植物葉片葉綠體發(fā)育；

12、(3)改變植物中植物激素含量；所述激素包括iaa、ck、ga、aba，與野生型相比，突變體株系中的iaa、ga和aba含量都較低，而ck含量較野生型略微升高，且突變體株系中的ck/iaa和ck/aba值都高于野生型；

13、(4)改變植物葉片中與(3)所述激素合成相關(guān)基因表達量；

14、(5)降低植物的形成層發(fā)育及木材積累。

15、其中，上述(4)所述的改變?nèi)~片中與激素代謝相關(guān)合成基因的表達量，具體表現(xiàn)在：與野生型相比，在下調(diào)的差異表達基因中，許多與激素代謝相關(guān)的過程相關(guān)聯(lián)，在fz1-l3基因編輯突變體中iaa、ga、aba合成的關(guān)鍵基因均下調(diào)，如iaa相關(guān)的taa、yucca；ck相關(guān)的ipt、log；ga相關(guān)的ga20ox；aba相關(guān)的psy、zep、nced等，然而ck合成的關(guān)鍵基因如ipt和log反而上調(diào)，這一結(jié)果與激素含量一致。此外，激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因也存在差異表達，如iaa相關(guān)的tir1；ck相關(guān)的ahp；ga相關(guān)的della；aba相關(guān)的abi5以及br相關(guān)的baki/bri1等，它們協(xié)同作用調(diào)控植物體內(nèi)激素水平。

16、通過檢測影響分枝發(fā)育關(guān)鍵蛋白的情況，tsa、tsb和ggpps，所有這些蛋白在fz1-l3基因編輯突變體中均顯著減少。其中，tsa的減少幅度最大，約相當(dāng)于野生型的25％。相比之下，zep和nced下降幅度較小，約相當(dāng)于野生型的60-75％。此外，ck生物合成的兩個關(guān)鍵酶ipt和log在野生型中增加了約20-30％。這些激素合成關(guān)鍵蛋白的含量降低，會導(dǎo)致激素合成受阻，同時會導(dǎo)致ck/iaa的比例升高，最后導(dǎo)致分枝增多表型。

17、本發(fā)明還保護一種植物育種方法，包括如下步驟：抑制植物中fz1基因的表達，從而得到具有矮化且分枝增多表型的植物。

18、本發(fā)明還保護一種植物育種方法，包括如下步驟：降低植物中fz1蛋白的含量和活性，從而得到具有矮化且分枝增多表型的植物。

19、所述影響植物分枝及株高具體表現(xiàn)為：與野生型相比，fz1基因編輯株系的株高更矮小，光合能力降低，頂端優(yōu)勢受到抑制，分枝增多，長勢較弱。

20、本發(fā)明還提供了一種培育矮小且分枝增多表型的植株的方法，所述方法包括如下1)或2)：

21、1)先降低具有正常株高且分枝正常表型植物中蛋白fz1活性或含量，得到轉(zhuǎn)基因植株，選取弱頂端優(yōu)勢且分枝增多表型的植株，即為矮小且分枝增多植株；

22、2)先抑制具有正常株高且分枝正常表型植物中fz1基因的表達，得到轉(zhuǎn)基因植株，選取弱頂端優(yōu)勢且分枝增多表型的植株，即為矮小且分枝增多植株。

23、更加具體地，抑制fz1基因表達的方式可以采用基因編輯技術(shù)，具體為：對具有正常株高且分枝正常表型植物中fz1基因進行基因編輯，使相應(yīng)蛋白質(zhì)翻譯提前終止，得到基因編輯植株，選取弱頂端優(yōu)勢且分枝增多表型的植株，即為矮小且分枝增多植株?；蛘邚幕蚓庉嬛仓甑淖越缓蟠蝎@得純合型基因編輯植株，純合型基因編輯植株的自交后代即為具有分枝增多表型的株系。所述自交后代可為自交1代的后代、自交2代的后代、自交3代的后代等，直至得到純合型基因編輯植株。純合型基因編輯植株的自交后代即為具有分枝增多表型的株系。

24、上述方法中，所述基因編輯通過如下實現(xiàn)：將crispr/cas9系統(tǒng)導(dǎo)入所述目的植物中；

25、所述crispr/cas9系統(tǒng)包括如下1)或2)：

26、1)sgrna，所述sgrna的靶點為seq?id?no.3第146-165位；

27、2)表達所述sgrna的crispr/cas9載體；

28、上述系統(tǒng)還包括cas9蛋白或其mrna或編碼cas9蛋白的核酸分子或表達cas9蛋白的質(zhì)粒。

29、在本發(fā)明的實施例中，載體具體可為：利用go1den?gate法(采用限制性內(nèi)切酶bsai)，將線性化的sgrna表達盒和pylcrisppr/cas9pubi-h質(zhì)粒連接，得到的重組質(zhì)粒。線性化的sgrna表達盒如序列表的seq?id?no.3所示。該質(zhì)粒含有靶序列(序列3第146-165位)，表達的特異sgrna如序列表的seq?id?no.4所示。

30、上述cas9蛋白為cas9基因編碼的蛋白質(zhì)。

31、本發(fā)明還保護一種抑制植物形成層發(fā)育及木材積累的方法，所述方法包括：

32、(1)通過抑制植物中蛋白fz1的活性或者降低植物中蛋白fz1的含量；

33、(2)通過抑制植物中fz1基因的表達；

34、其中，抑制植物中fz1基因的表達的方式可以為基因敲除。

35、另外，在實際的育種過程中，可以根據(jù)實際情況采用不同的方式對該基因進行基因編輯或者過表達操作，以達到不同的目的，比如，為了促進植物形成層發(fā)育和木材積累的方法，可以采用：

36、(1)通過促提高植物中蛋白fz1的活性或者提高植物中蛋白fz1的含量；

37、(2)通過提高植物中fz1基因的表達；

38、促進植物中fz1基因的表達的方式可以采用過表達或者超表達。

39、對于適用于本發(fā)明的植物沒有特別的限制，不僅包括楊樹，還可以是其他同源性高的植物，只要其適合進行基因的轉(zhuǎn)化操作，如各種農(nóng)作物、花卉植物或林業(yè)植物等均可。所述的植物比如可以是(不限于)：雙子葉植物、單子葉植物、木本植物、薔薇目植物、薔薇科植物、桃屬、桃、十字花科植物、擬南芥屬植物、擬南芥等。

40、本發(fā)明中所說的“植物”包括整株植物，其親本和子代植株以及植物的不同部位，包括種子、果實、芽、莖、葉、根(包括塊莖)、花、組織和器官，在這些不同的部分均有我們目的基因或者核酸。這里所提及的“植物”也包括植物細胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣，其中每種前述對象包含目的基因/核酸。

41、本發(fā)明包括任何植物細胞，或任何由其中的方法獲得或可獲得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本專利也包含由任何前述方法所獲得的轉(zhuǎn)染細胞、組織、器官或完整植物。唯一的要求是子代表現(xiàn)出相同的基因型或表型特征，使用本專利中的方法獲得的子代特性相同。

42、本發(fā)明還擴展到如上所述的植物的可收獲的部分，但不限于種子、葉、果實、花、莖、根、根莖、塊莖和球莖。同時進一步涉及植株收獲后的其他衍生物，如干燥顆?；蚍勰⒂?、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及由相關(guān)植物獲得的食品或食品添加劑。

43、本發(fā)明的優(yōu)點：

44、本發(fā)明中通過crispr/cas9基因編輯技術(shù)對fz1基因進行基因編輯，fz1純合突變體表現(xiàn)為明顯的矮小且分枝增多的表型。fz1蛋白定位于葉綠體內(nèi)，fz1的缺失致使葉綠體發(fā)育受到影響，進而影響激素合成，產(chǎn)生矮小且分枝增多的表型。

45、本發(fā)明提供了fz1基因在調(diào)控植物分枝及株高表型中的應(yīng)用。經(jīng)發(fā)明人研究，首次發(fā)現(xiàn)了植物分枝發(fā)育相關(guān)的fz1，該基因缺失能夠促進植物的分枝發(fā)育及矮化植株，可在植物分子育種和創(chuàng)制優(yōu)良材性植物新種質(zhì)中進行應(yīng)用。

46、在實際生產(chǎn)中本發(fā)明可獲得矮小及分枝增多表型植物，為植物提供理論及技術(shù)支持。本發(fā)明對定向、快速、高效培育高產(chǎn)植物，提高育種效率等方面都具有十分重要的理論和實際意義。

47、另外，研究還發(fā)現(xiàn)，基因缺失突變體植株的形成層發(fā)育及木材積累能力都顯著低于野生型，說明該基因fz1的缺失對植物木材發(fā)育具有重要影響，所以在實際的育種過程中還可以根據(jù)實際的需要，對fz1基因進行過表達，獲得過表達植株，從而得到形成層發(fā)育得到提高及木材積累能力增強的植物。