本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種鴿蛋清糖肽及其制備方法與應用。

背景技術(shù)：

1、鴿蛋為鳩鴿科動物原鴿或家鴿等的蛋，鴿蛋清中含有許多礦物質(zhì)和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，能夠為人體提供必需氨基酸，滿足人體的部分營養(yǎng)需求。另外，鴿蛋清來源蛋白的氨基酸組成和糖基化位點與其他禽蛋來源的蛋白均有較大區(qū)別，使其在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定的特殊性，因此鴿蛋清卵白蛋白在傷口修復和延緩衰老方面有較好的應用前景。

2、蛋白的水解產(chǎn)物多肽被認為具有多種生理活性，其結(jié)構(gòu)中帶有寡糖或多糖片段，形成的糖肽可以兼具糖和肽的活性，但其制備技術(shù)相較于大分子卵白蛋白要更加復雜，分離和純化難度較高，具體生物活性和作用機制的研究仍不全面?，F(xiàn)有技術(shù)中對鴿蛋清糖肽的研究還比較少，因此，挖掘鴿蛋清中的有效活性小分子糖肽的制備及其功能，有助于鴿蛋產(chǎn)品的開發(fā)和高值化利用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鴿蛋清糖肽。

2、本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述鴿蛋清糖肽的制備方法。

3、本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述鴿蛋清糖肽在抑制結(jié)腸癌細胞增殖中的應用。

4、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

5、一種鴿蛋清糖肽，所述鴿蛋清糖肽的氨基酸序列為kvlhfdnvtevgda(如seq?inno.1所示)。

6、經(jīng)測定，所述鴿蛋清糖肽的分子量為1543.0kda。

7、其中，所述鴿蛋清糖肽為n糖基化修飾的鴿蛋清糖肽。

8、具體的，所述n糖基化修飾，其糖型包括n3h5、n4h6s1、n5h6s1、n5h7s1、n5h7s2、n6h6s1、n6h7s1、n6h7s2、n7h6s1、n7h7中的任意一種或幾種的組合。

9、其中，所述n代表n-乙酰葡萄糖胺(glcnac)，所述h代表甘露糖(man)或半乳糖(gal)，所述s代表唾液酸(neunac)，數(shù)字則表示相應糖單元的數(shù)量。

10、編碼所述鴿蛋清糖肽的核酸分子也在本發(fā)明所保護的范圍之內(nèi)。

11、一種鴿蛋清糖肽的制備方法，包括如下步驟：

12、(1)將熱變性后的鴿蛋卵白蛋白溶液冷卻至室溫，調(diào)節(jié)ph至2.0～4.0后，加入胃蛋白酶進行第一次酶解；

13、(2)待第一次酶解結(jié)束后，調(diào)節(jié)ph至7.0～8.0，加入胰蛋白酶進行第二次酶解；待第二次酶解結(jié)束，加熱至100℃保持10～15min再冷卻后，調(diào)節(jié)ph至6.0～7.0，離心取酶解液；

14、(3)將酶解液經(jīng)超濾管離心取濾過液，再依次經(jīng)離子交換柱和凝膠柱分離后干燥，獲得所述鴿蛋清糖肽粉末。

15、其中，步驟(1)中，所述鴿蛋卵白蛋白溶液的濃度為35～45g/l，溶劑為水。

16、在本發(fā)明的一些實施例中，所述鴿蛋卵白蛋白溶液的濃度為40g/l，溶劑為水。

17、其中，步驟(1)中，所述熱變性，其條件為：75～90℃熱變性15～20min。

18、在本發(fā)明的一些實施例中，所述熱變性，其條件為：75～85℃熱變性20min。

19、其中，步驟(1)中，所述胃蛋白酶，其加入量為鴿蛋卵白蛋白質(zhì)量的3～7wt％。

20、在本發(fā)明的一些實施例中，所述胃蛋白酶，其加入量為鴿蛋卵白蛋白質(zhì)量的6wt％。

21、其中，步驟(1)中，所述第一次酶解，其酶解條件為：120～160r/min、25～40℃的水浴搖床中反應2～4h。

22、在本發(fā)明的一些實施例中，所述第一次酶解，其酶解條件為：120r/min、37℃的水浴搖床中反應2h。

23、其中，步驟(2)中，所述胰蛋白酶，其加入量為鴿蛋卵白蛋白質(zhì)量的1～3wt％。

24、在本發(fā)明的一些實施例中，所述胰蛋白酶，其加入量為鴿蛋卵白蛋白質(zhì)量的2wt％。

25、其中，步驟(2)中，所述第二次酶解，其酶解條件為：120～160r/min、25～40℃的水浴搖床中反應2～4h。

26、在本發(fā)明的一些實施例中，所述第二次酶解，其酶解條件為：120r/min、35℃的水浴搖床中反應2h。

27、其中，步驟(3)中，所述二次離心，采用mw?3000～10000da超濾管。

28、在本發(fā)明的一些實施例中，所述二次離心，采用mw?3000da超濾管。

29、其中，步驟(3)中，所述離子交換柱在本發(fā)明一些實施例中為c18，所述凝膠柱在本發(fā)明一些實施例中為ge?s300。

30、其中，步驟(3)中，所述干燥為噴霧干燥、冷凍干燥或真空減壓濃縮干燥中的任意一種；優(yōu)選為噴霧干燥。

31、具體的，所述噴霧干燥，其條件為：溫度80～120℃、進料流量8～15ml/min、進料溫度20～40℃、出口溫度60～80℃。

32、所述鴿蛋清糖肽在制備治療結(jié)腸癌藥物中的應用也在本發(fā)明所保護的范圍之內(nèi)。

33、其中，所述鴿蛋清糖肽抑制結(jié)腸癌細胞增殖。

34、具體的，經(jīng)細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，鴿蛋清糖肽對結(jié)腸癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量關(guān)系，抑制率隨樣品濃度增加而提高。

35、具體的，經(jīng)細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，鴿蛋清糖肽具有抑制結(jié)腸癌細胞擴增的能力，且對鴿蛋清糖肽劑量無明顯依賴。在鴿蛋清糖肽添加量為20μg/ml，處理48h的情況下，與不添加鴿蛋清糖肽相比，caco-2細胞的平均遷移率降低了15.57％。

36、有益效果：

37、(1)本發(fā)明經(jīng)過二次酶解，首次從鴿蛋清中分離并鑒定獲得了具有有效活性的小分子鴿蛋清糖肽，其氨基酸序列為kvlhfdnvtevgda。

38、(2)本發(fā)明制備得到的鴿蛋清糖肽具有顯著的抑制結(jié)腸癌細胞增殖、擴增的能力，具有潛在的抗腫瘤活性。在鴿蛋清糖肽添加量為20μg/ml的情況下，處理48h的情況下，與不添加糖肽相比，caco-2細胞的平均遷移率降低了15.57％。

39、(3)本發(fā)明鴿蛋清糖肽的制備工藝簡單，提高了鴿蛋的附加價值，有助于鴿蛋清蛋白和小分子糖肽的深入研究，對于鴿蛋的產(chǎn)品開發(fā)具有重要的意義。

技術(shù)特征：

1.一種鴿蛋清糖肽，其特征在于，鴿蛋清糖肽的氨基酸序列為kvlhfdnvtevgda。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴿蛋清糖肽，其特征在于，所述鴿蛋清糖肽為n糖基化修飾的鴿蛋清糖肽。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴿蛋清糖肽，其特征在于，所述n糖基化修飾，其糖型包括n3h5、n4h6s1、n5h6s1、n5h7s1、n5h7s2、n6h6s1、n6h7s1、n6h7s2、n7h6s1、n7h7中的任意一種或幾種的組合；

4.一種核酸分子，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述鴿蛋清糖肽。

5.權(quán)利要求1所述的鴿蛋清糖肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述鴿蛋卵白蛋白溶液的濃度為35～45g/l，溶劑為水；所述熱變性，其條件為：75～90℃熱變性15～20min；所述胃蛋白酶，其加入量為鴿蛋卵白蛋白質(zhì)量的3～7wt％；所述第一次酶解，其酶解條件為：120～160r/min、25～40℃的水浴搖床中反應2～4h。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述胰蛋白酶，其加入量為鴿蛋卵白蛋白質(zhì)量的1～3wt％；所述第二次酶解，其酶解條件為：120～160r/min、25～40℃的水浴搖床中反應2～4h。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述超濾管離心，采用mw3000～10000da超濾管；所述干燥為噴霧干燥、冷凍干燥或真空減壓濃縮干燥中的任意一種，其中，所述噴霧干燥，其條件為：溫度80～120℃、進料流量8～15ml/min、進料溫度20～40℃、出口溫度60～80℃。

9.權(quán)利要求1～3任意一項所述鴿蛋清糖肽在制備治療結(jié)腸癌藥物中的應用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于，所述鴿蛋清糖肽抑制結(jié)腸癌細胞增殖。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鴿蛋清糖肽及其制備方法與應用。本發(fā)明所述鴿蛋清糖肽，其氨基酸序列為KVLHFDNVTEVGDA，存在N糖基化修飾。本發(fā)明制備得到的鴿蛋清糖肽具有顯著的抑制結(jié)腸癌細胞擴增的能力，具有潛在的抗腫瘤活性，在低劑量鴿蛋清糖肽下，能降低結(jié)腸癌細胞的遷移能力。所述鴿蛋清糖肽，其制備工藝簡單，提高了鴿蛋的附加價值，有助于鴿蛋清蛋白和小分子糖肽的深入研究，對于鴿蛋的產(chǎn)品開發(fā)具有重要的意義。

技術(shù)研發(fā)人員：孟俊,楊海明,周慧
受保護的技術(shù)使用者：南京衛(wèi)斯登生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15