本技術(shù)屬于生物學，具體地，涉及一種基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記檢測與富集糖基化rna的方法。

背景技術(shù)：

1、糖基化修飾是真核生物體內(nèi)最重要、最普遍的修飾之一，其可調(diào)節(jié)體內(nèi)諸多生理功能，如蛋白質(zhì)的正確折疊和運輸、信號轉(zhuǎn)導等。既往研究發(fā)現(xiàn)，糖基化修飾常發(fā)生在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)上，而2021年carolyn?r.bertozzi和ryan?a.flynn團隊在《cell》上報道，哺乳動物來源的small?rna能發(fā)生n-連接形式的糖基化修飾，為糖基化修飾打開了一扇新的大門。其通過ac4mannaz(cas：1213701-11-1)標記試劑，代謝標記體內(nèi)的唾液酸，進而標記體內(nèi)所有能發(fā)生唾液酸化修飾的糖基化生物大分子，其中則包括sialoglycorna(唾液酸化糖基化rna)。此團隊的進一步實驗表明，該類sialoglycorna的糖基是以n-連接形式連在rna上，且rna-seq表明，該類sialoglycorna是small?rna，包括trna、yrna、snrna、rrna等。同時，細胞亞定位實驗表明，sialoglycorna主要位于細胞膜外側(cè)，且進一步實驗表明，sialoglycorna能夠被ds?rna抗體識別，還可以作為免疫球蛋白樣凝集素(siglec)受體的直接配體，在免疫調(diào)控中可能起重要作用。最近，耶魯大學的研究團隊zhang?ningning和lu?jun的研究表明，細胞表面的sialoglycorna能調(diào)控中性粒細胞的招募。因此，sialoglycorna作為一種潛在的參與免疫調(diào)控和信號傳導相關(guān)的分子，對其開發(fā)相應(yīng)的檢測手段，是研究和應(yīng)用的重要前提。

2、目前已知的sialoglycorna的檢測手段主要有以下兩種。carolyn?r.bertozzi和ryan?a.flynn團隊利用ac4mannaz標記試劑，代謝標記sialoglycorna上的唾液酸，從而在sialoglycorna的唾液酸上引入疊氮基團，再通過后續(xù)與dbco-peg4-biotin進行點擊化學反應(yīng)，給sialoglycorna標記上biotin(生物素)基團，則可順利開展后續(xù)的檢測或富集。luyi和ma?yuan團隊在《nature?biotechnology》上報道，其團隊利用鄰位連接技術(shù)(proximity?ligation?assay)研發(fā)了一種名為arpla的sialoglycorna原位成像方法。該方法的原理是利用核酸適配體和rna原位雜交分別識別sialoglycorna的糖基和rna部分，再利用dna鄰位連接技術(shù)，生成完整的環(huán)狀dna，以其作為滾環(huán)擴增的模板，產(chǎn)生長序列單鏈dna。然后，該dna產(chǎn)物通過與熒光基團標記的dna探針雜交，可用于提供sialoglycorna的位置和豐度信息。

3、當前的兩種sialoglycorna的檢測方法雖然已經(jīng)取得了很大的進展，但是也存在一些缺點：

4、carolyn?r.bertozzi和ryan?a.flynn團隊代謝標記的方法，需要在sialoglycorna生成之前，即細胞培養(yǎng)階段就加入ac4mannaz進行代謝標記。因此，對于不能進行代謝標記的樣本則不適用，如臨床病理組織等。同時，ac4mannaz作為一種疊氮化物，是一種劇毒物，且易爆炸；作為一種代謝標記試劑，其標記效率有限，存在著一定量的sialoglycorna沒有被標記到的可能，會造成一定的結(jié)果偏移。

5、lu?yi和ma?yuan團隊的arpla的sialoglycorna原位成像方法，由于sialoglycorna的rna部分的組成具有多樣性，許多不同的small?rna都能被糖基化修飾，因其利用的rna原位雜交技術(shù)，只能針對其中某種特定的rna序列，所以這種檢測方法只能檢測特定small?rna生成的sialoglycorna，只占總體sialoglycorna信號的一小部分，因此若用來代表總體的sialoglycorna信號，會有一定程度的信號失真。其次，該技術(shù)只適合用于原位成像，對sialoglycorna的富集，則無能為力。而且，核酸適配體和rna原位雜交鏈，以及后續(xù)的pla技術(shù)都造價不菲，成本較高，不利于推廣利用。

6、因此，開發(fā)一種操作簡單、特異性和靈敏性良好、且成本低的方法檢測天然生成的sialoglycorna，具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有檢測方法的缺點，本技術(shù)通過α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶，將帶有標記基團的唾液酸(sialic?acid)催化轉(zhuǎn)移至sialoglycorna糖鏈末端的唾液酸上，進而標記天然生成的sialoglycorna；可直接得到帶有可檢測基團(如熒光基團或biotin(生物素))的sialoglycorna，或進一步通過后續(xù)的反應(yīng)(如點擊化學反應(yīng))引入可檢測基團(如熒光基團或biotin(生物素))，即可進行后續(xù)的信號檢測或富集；并且能夠進一步對rna部分和糖基部分進行測序。本技術(shù)為sialoglycorna的檢測和富集提供了一種非常高效簡便的檢測手段。本技術(shù)所述sialoglycorna包括所有存在被唾液酸修飾的糖基化rna，與其rna大小、類型和序列、糖基的連接形式和結(jié)構(gòu)無關(guān)；包括培養(yǎng)的細胞中生成的sialoglycorna和其他樣品中的sialoglycorna；其他樣品包括組織和體液。

2、在第一方面，本技術(shù)提供一種基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記糖基化rna的方法，其包括以下步驟：使用α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶、帶有標記基團的cmp-sialicacid，將帶有標記基團的唾液酸轉(zhuǎn)移至rna樣品中sialoglycorna的糖鏈末端唾液酸上，得到帶有標記基團的sialoglycorna。

3、在一些實施方式中，所述α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶為細菌來源的α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶，如來源于空腸彎曲菌的cst?ii、來源于流血嗜血桿菌的lic3b，及其衍生的具備α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的相應(yīng)突變體、截短體；優(yōu)選為cst?ii及其衍生的具備α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的相應(yīng)截短體，如：cst-iiδ32i53s，序列如seq?id?no.2所示。

4、在一些實施方式中，所述帶有標記基團的cmp-sialic?acid中的標記基團包括可檢測基團(如熒光基團、生物素)、或可進一步通過反應(yīng)(如點擊化學反應(yīng)，具體可為無銅點擊化學反應(yīng)、銅催化的點擊化學反應(yīng))引入可檢測基團(如熒光基團、生物素)的基團(如疊氮、炔基)。

5、所述熒光基團是cy5、cy3等；優(yōu)選為cy5。

6、所述帶有標記基團的cmp-sialic?acid可以為疊氮標記的cmp-azide-sialicacid、炔基標記的cmp-alkynyl-sialic?acid、生物素標記的cmp-biotin-sialic?acid、熒光基團標記的cmp-cy5-sialic?acid。

7、在一些實施方式中，所述基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記糖基化rna的方法，所述標記基團為可進一步通過反應(yīng)引入可檢測基團的基團時，所述方法進一步包括通過標記基團參與的反應(yīng)將可檢測基團引入到唾液酸上，得到帶有可檢測基團的sialoglycorna。

8、所述帶有標記基團的cmp-sialic?acid為疊氮標記的cmp-azide-sialic?acid時，所述方法進一步包括通過疊氮與點擊化學試劑的無銅點擊化學反應(yīng)將可檢測基團(如熒光基團、生物素)引入到唾液酸上。所述點擊化學試劑包括dbco-peg4-biotin、dbco-熒光基團(如dbco-cy5)以及其他所有帶有biotin或熒光基團的點擊化學試劑。點擊化學試劑的濃度為0.1-100mm，優(yōu)選為0.5-10mm?？杉尤雂f-glbii?buffer和點擊化學試劑，在室溫及以上溫度反應(yīng)進行點擊化學反應(yīng)，例如在室溫-80℃，優(yōu)選在55℃反應(yīng)，反應(yīng)時間可為10min以上(如10-60min)，之后加水(如depc水)終止反應(yīng)。

9、所述帶有標記基團的cmp-sialic?acid為炔基標記的cmp-alkynyl-sialic?acid時，所述方法一步包括通過炔基與點擊化學試劑的銅催化點擊化學反應(yīng)將可檢測基團(如熒光基團、生物素)引入到唾液酸上。所述點擊化學試劑包括n3-biotin、n3-熒光基團(如n3-cy5)以及其他所有帶有biotin或熒光基團的點擊化學試劑。點擊化學試劑的濃度為0.1-100mm，優(yōu)選為0.5-10mm?？杉尤隿uso4、tbta、tcep和點擊化學試劑進行點擊化學反應(yīng)。

10、在一些實施方式中，基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記糖基化rna的方法，包括以下步驟，將rna樣品、α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶、帶有標記的cmp-sialic?acid、金屬離子、以及任選的rnase抑制劑在緩沖溶液中在一定溫度下共孵育一段時間，得到帶有標記基團的sialoglycorna。優(yōu)選地，反應(yīng)體系中包含rnase抑制劑，濃度為0.01-10u/μl，如0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10u/μl，更優(yōu)選為1u/μl。

11、在一些實施方式中，所述緩沖溶液的ph＝6.0-7.5，優(yōu)選為ph＝6.0-7.0。所述緩沖溶液為tris緩沖液(如tris·hcl)、醋酸鹽(如醋酸鈉)緩沖液(如醋酸鈉緩沖液)、檸檬酸鹽(檸檬酸鈉)緩沖液、hepes緩沖液等。優(yōu)選地，所述緩沖溶液為tris·hcl緩沖液、醋酸鈉緩沖液。所述緩沖溶液的濃度為5-200mm，如5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160m、170mm、180mm、190mm、200mm，優(yōu)選為50-150mm，更優(yōu)選100mm。

12、在一些實施方式中，所述金屬離子選自mg2+、ca2+等。所述金屬離子由其金屬氯化物、金屬溴化物、金屬硝酸鹽、金屬硫酸鹽等金屬鹽提供；優(yōu)選地，所述金屬離子由金屬氯化物，如mgcl2提供。反應(yīng)體系中所述金屬離子濃度為1-20mm，如1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm，優(yōu)選為5-10mm。

13、在一些實施方式中，反應(yīng)體系中，rna濃度小于等于100mg/ml，如0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100mg/ml，優(yōu)選為0.01-10mg/ml，更優(yōu)選為0.1-1mg/ml。

14、在一些實施方式中，所述α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的濃度為0.01-10mg/ml，如0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/ml，優(yōu)選為1-5mg/ml。

15、在一些實施方式中，所述帶有標記的cmp-sialic?acid的濃度為1μm-20mm，如1、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900μm或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mm，優(yōu)選為1-15mm，更優(yōu)選為3-10mm。

16、在一些實施方式中，所述孵育的溫度為4-40℃，如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40℃，優(yōu)選為35-38℃，更優(yōu)選為37℃。所述孵育時間為10min-360min，如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、210、240、270、300、330、360min，優(yōu)選為60-240min。

17、在一些實施方式中，所述基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記糖基化rna的方法，具體包括以下步驟：

18、s1：提取待測樣品的總rna；任選地，使用蛋白酶k處理，并純化rna樣品；

19、s2：使用α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶、帶有標記基團的cmp-sialic?acid，將帶有標記基團的唾液酸轉(zhuǎn)移至rna樣品中sialoglycorna的糖鏈末端唾液酸上，得到帶有標記基團的sialoglycorna；純化rna樣品；

20、s3：任選地，所述帶有標記基團的cmp-sialic?acid中的標記基團為可進一步通過反應(yīng)引入可檢測基團的基團時，通過標記基團參與的反應(yīng)將可檢測基團引入到唾液酸上，得到帶有可檢測基團的sialoglycorna；純化rna樣品。

21、在一些實施方式中，所述步驟s1中的提取總rna的方法、純化rna樣品，步驟s2-s3中的純化rna樣品的方法，可以是本領(lǐng)域常用的方法，如trizol法、磁珠法、柱式法；優(yōu)選使用depc水溶解rna。

22、在一些實施方式中，所述步驟s1中，提取總rna后，加入蛋白酶k消化潛在的糖基化蛋白的污染，并再次純化rna樣品。優(yōu)選地，所述步驟s1如下：

23、(1)向待測樣品中加入適量trizol，震蕩混勻，37℃孵育10分鐘；

24、(2)以1:5的比例加入氯仿，震蕩混勻，冰上靜置；

25、(3)4℃離心，吸取上清，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后，4℃靜置；

26、(4)4℃離心，去上清，用70％乙醇洗滌沉淀，離心后再重復洗滌一次；

27、(5)4℃離心，去上清，室溫下風干，用depc水溶解，得到總rna溶液；

28、(6)加入蛋白酶k處理，37℃消化45min；

29、(7)加入適量trizol，再次重復提取rna的步驟，最后用depc水溶解，得到總rna溶液。

30、在第二方面，本技術(shù)提供第一方面所述的基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記糖基化rna的方法的用途，其用于檢測糖基化rna、富集糖基化rna、糖基化rna的rna部分測序或糖基化rna的糖基部分測序。

31、在一些實施方式中，所述檢測糖基化rna，是通過電泳、熒光成像，rna?blotting，elisa或酶標儀對帶有可檢測基團的sialoglycorna進行檢測。

32、所述可檢測基團為熒光基團時，可通過電泳、熒光成像進行檢測，或使用酶標儀進行檢測；具體地，在甲醛變性瓊脂糖凝膠中電泳、熒光成像，或者直接在酶標儀中檢測熒光信號。優(yōu)選地，使用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠，在帶有可檢測基團的sialoglycorna樣品中加入2×rna?loading，變性后電泳，115v下30分鐘，之后熒光成像。

33、所述可檢測基團為生物素時，可通過rna?blotting進行檢測；如通過電泳、轉(zhuǎn)印、化學發(fā)光成像進行rna?blotting檢測。具體地，電泳(如在甲醛變性瓊脂糖凝膠中電泳)，將rna轉(zhuǎn)印至nc膜上，轉(zhuǎn)印后紫外交聯(lián)，封閉液封閉，加入streptavidin-hrp(鏈霉親和素-辣根過氧化物酶)孵育，利用結(jié)合的hrp進行化學發(fā)光成像。優(yōu)選地，使用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠，在帶有可檢測基團的sialoglycorna樣品中加入2×rna?loading，變性后電泳，115v下30分鐘；與northern?blotting實驗類似，將rna轉(zhuǎn)到0.45μm的nc膜上；轉(zhuǎn)印后紫外交聯(lián)，封閉液封閉，加入streptavidin-hrp孵育，洗滌液洗滌；利用結(jié)合的hrp進行化學發(fā)光成像，即可檢測sialoglycorna的信號。

34、在一些實施方式中，所述富集糖基化rna，是指通過第一方面所述方法得到帶有生物素的sialoglycorna；對帶有可生物素的sialoglycorna進行富集。

35、可使用鏈霉親和素磁珠進行富集，再進行洗脫得到富集后的sialoglycorna。具體地，利用糖原封閉鏈霉親和素磁珠，再將帶有生物素的sialoglycorna與鏈霉親和素磁珠共孵育(1-10℃，優(yōu)選為4-8℃)，洗去非特異性結(jié)合后，洗脫使sialoglycorna上的生物素與鏈霉親和素磁珠解離，純化得到富集后的sialoglycorna。優(yōu)選地，具體步驟如下：利用糖原(glycogen)封閉鏈霉親和素磁珠，再將帶有生物素的sialoglycorna與鏈霉親和素磁珠在4℃下共孵育；使用洗滌液洗去非特異結(jié)合，再加入trizol，70℃下10分鐘，使sialoglycorna上的生物素與鏈霉親和素磁珠解離；轉(zhuǎn)移上述trizol，提取rna，期間需加入糖原(glycogen)促沉，最后用depc水溶解，即可得到富集后的sialoglycorna。

36、在一些實施方式中，所述糖基化rna的rna部分測序或糖基化rna的糖基部分測序是指按照上述方法得到富集后的sialoglycorna，再進行rna測序或糖基測序。

37、所述rna測序的具體步驟包括：使用rna建庫試劑盒對富集后的sialoglycorna進行建庫，上機測序，比對分析。優(yōu)選地，使用rna建庫試劑盒(如small?rnalibrary?prep?set?for?illumina)進行建庫，測序平臺(如illumina的nextseq500instrument測序平臺)測序，數(shù)據(jù)庫比對分析。

38、所述糖基測序的具體步驟包括：對富集后的sialoglycorna進行pngase?f酶切、色譜柱分離、質(zhì)譜鑒定。優(yōu)選地，使用pngasef(neb)37℃過夜酶切，pgc?spe?columns(賽默飛)分離糖基，使用lumos?orbitrap?mass?spectrometer進行質(zhì)譜鑒定。

39、在第三方面，本技術(shù)提供一種基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記檢測糖基化rna的方法，其包括以下步驟，

40、通過第一方面所述方法得到帶有可檢測基團的sialoglycorna；

41、對帶有可檢測基團的sialoglycorna進行檢測。

42、在一些實施方式中，通過電泳、熒光成像，rna?blotting，elisa或酶標儀對帶有可檢測基團的sialoglycorna進行檢測。

43、在一些實施方式中，所述可檢測基團為熒光基團時，可通過電泳、熒光成像進行檢測，或使用酶標儀進行檢測；具體地，在甲醛變性瓊脂糖凝膠中電泳、熒光成像，或者直接在酶標儀中檢測熒光信號。優(yōu)選地，使用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠，在帶有可檢測基團的sialoglycorna樣品中加入2×rna?loading，變性后電泳，115v下30分鐘，熒光成像。

44、在一些實施方式中，所述可檢測基團為生物素時，可通過rna?blotting進行檢測；如通過電泳、轉(zhuǎn)印、化學發(fā)光成像進行rna?blotting檢測。具體地，電泳(如在甲醛變性瓊脂糖凝膠中電泳)，將rna轉(zhuǎn)印至nc膜上，轉(zhuǎn)印后紫外交聯(lián)，封閉液封閉，加入streptavidin-hrp(鏈霉親和素-辣根過氧化物酶)孵育，利用結(jié)合的hrp進行化學發(fā)光成像。優(yōu)選地，使用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠，在帶有可檢測基團的sialoglycorna樣品中加入2×rnaloading，變性后電泳，115v下30分鐘；與northern?blotting實驗類似，將rna轉(zhuǎn)到0.45μm的nc膜上；轉(zhuǎn)印后紫外交聯(lián)，封閉液封閉，加入streptavidin-hrp孵育，洗滌液洗滌；利用結(jié)合的hrp進行化學發(fā)光成像，即可檢測sialoglycorna的信號。

45、在第四方面，本技術(shù)提供一種基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記富集糖基化rna的方法，其包括以下步驟，

46、通過第一方面所述方法得到帶有生物素的sialoglycorna；

47、對帶有可生物素的sialoglycorna進行富集。

48、在一些實施方式中，可使用鏈霉親和素磁珠進行富集，再進行洗脫得到富集后的sialoglycorna。具體地，利用糖原封閉鏈霉親和素磁珠，再將帶有生物素的sialoglycorna與鏈霉親和素磁珠共孵育(1-10℃，優(yōu)選為4-8℃)，洗去非特異性結(jié)合后，洗脫使sialoglycorna上的生物素與鏈霉親和素磁珠解離，純化得到富集后的sialoglycorna。優(yōu)選地，具體步驟如下：利用糖原(glycogen)封閉鏈霉親和素磁珠，再將帶有生物素的sialoglycorna與鏈霉親和素磁珠在4℃下共孵育；使用洗滌液洗去非特異結(jié)合，再加入trizol，70℃下10分鐘，使sialoglycorna上的生物素與鏈霉親和素磁珠解離；轉(zhuǎn)移上述trizol，提取rna，期間需加入糖原(glycogen)促沉，最后用depc水溶解，即可得到富集后的sialoglycorna。

49、在第五方面，本技術(shù)提供第四方面所述的富集糖基化rna的方法在對sialoglycorna的rna部分測序或糖基部分測序中的用途。

50、在第六方面，本技術(shù)提供一種對sialoglycorna的rna部分測序的方法，其包括采用本技術(shù)第四方面所述的富集糖基化rna的方法得到富集后的sialoglycorna，再進行rna測序。

51、在一些實施方式中，所述rna測序的具體步驟包括：使用rna建庫試劑盒對通過第四方面所述方法得到的富集后的sialoglycorna進行建庫，上機測序，比對分析。優(yōu)選地，使用rna建庫試劑盒(如small?rna?library?prep?set?for?illumina)進行建庫，測序平臺(如illumina的nextseq?500instrument測序平臺)測序，數(shù)據(jù)庫比對分析。

52、在第七方面，本技術(shù)提供一種對sialoglycorna的糖基部分測序的方法，其包括采用本技術(shù)第四方面所述的富集糖基化rna的方法得到富集后的sialoglycorna，再進行糖基測序。

53、在一些實施方式中，對通過第四方面所述方法得到的富集后的sialoglycorna進行pngase?f酶切、色譜柱分離、質(zhì)譜鑒定。優(yōu)選地，使用pngasef(neb)37℃過夜酶切，pgcspe?columns(賽默飛)分離糖基，使用lumos?orbitrap?mass?spectrometer進行質(zhì)譜鑒定。

54、在第八方面，本技術(shù)提供一種基于α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的體外酶化學標記檢測或富集糖基化rna的試劑盒，其包括：

55、用于體外酶化學標記的試劑，包括如第一方面所述的α-2,8型唾液酸轉(zhuǎn)移酶，如第一方面所述的帶有標記基團的cmp-sialic?acid；任選的如第一方面所述的點擊化學試劑；任選的如第一方面所述的緩沖溶液；任選的如第一方面所述的金屬離子；

56、任選的用于檢測帶有生物素的sialoglycorna的streptavidin-hrp；

57、任選的用于富集帶有生物素的sialoglycorna的鏈霉親和素磁珠。

58、在一些實施方式中，所述試劑盒還包括rnase抑制劑。

59、在一些實施方式中，所述試劑盒還包括rna提取用試劑和/或耗材，如trizol法、磁珠法或柱式法所用試劑和/或耗材。

60、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)的有益效果為：

61、(1)相較于現(xiàn)有的檢測和富集技術(shù)，本技術(shù)能夠?qū)λ胁煌愋偷纳飿颖緛碓吹膕ialoglycorna進行標記、量的檢測、富集以及rna測序分析和糖基的結(jié)構(gòu)鑒定，其中包括培養(yǎng)的細胞、組織、體液等樣本來源的sialoglycorna。

62、(2)本技術(shù)所述的sialoglycorna標記方法，與現(xiàn)有技術(shù)的標記方法相比，具有高特異性和高靈敏性的特點，無明顯副產(chǎn)物。相較于代謝標記，本技術(shù)無需在細胞培養(yǎng)階段加入如ac4mannaz等代謝標記試劑，可避免其潛在的細胞毒性和對細胞代謝的影響，反應(yīng)真實的sialoglycorna的水平。

63、(3)本技術(shù)所述的sialoglycorna標記檢測與富集方法，所用到的試劑價格低廉，無需昂貴的儀器，且操作簡單方便，利于廣泛推廣和應(yīng)用。

64、(4)本技術(shù)所述的sialoglycorna標記方法，可直接通過一步反應(yīng)在sialoglycorna上引入帶有可檢測基團的唾液酸，直接進行檢測或富集。

65、(5)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，本技術(shù)所述的sialoglycorna標記方法，使用cst?ii以及其截短體，具有最優(yōu)的標記效果，在ph＝60-7.5時具有最優(yōu)的標記效果。