本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，具體涉及一種靶向angptl4的嵌合抗原受體巨噬細胞及其制備方法和應用。

背景技術：

1、嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor,car)是一種人工轉染免疫細胞后使其表達于細胞表面的跨膜蛋白。car主要由三個功能域構成，分別是胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域。胞外結構域由負責識別并結合抗原的單鏈可變片段(scfv)及一段起連接作用的鉸鏈區(qū)(hinge)構成。胞內結構域由共刺激結構域和信號轉導結構域構成。通過設計不同的胞外結構域以實現(xiàn)靶向吞噬對應細胞/蛋白，并可通過多變的胞內結構域激活工具細胞的不同功能。目前常見的用于搭載car的工具細胞主要有t淋巴細胞(t細胞)、巨噬細胞(m細胞)、自然殺傷細胞(nk細胞)等。car-m細胞療法是指將經(jīng)過編輯的特定car基因植入巨噬細胞，以裝備巨噬細胞，使之能夠通過特異性抗原識別并激活巨噬細胞的活性，進而實現(xiàn)靶向吞噬。

2、血管生成素樣蛋白4(angptl4，angiopoietin-related?protein?4，ensembl:ensg00000167772，uniprotkb/swiss-prot:q9by76)是一種主要由內皮細胞分泌的功能蛋白。人類angptl4基因在不同物種之間非常保守，與小鼠的氨基酸序列相似性為77％。人類angptl4基因位于染色體19p13.3上，編碼分子量為45–65kda的糖蛋白。與該家族的其他成員類似，angptl4包含n端卷曲螺旋結構和c端纖維蛋白原樣結構域。angptl4的功能存在組織差異。angptl4最初在肝臟中被發(fā)現(xiàn)為脂質代謝的關鍵調節(jié)因子，還參與血管通透性、血管生成和炎癥信號傳導。使用angptl4敲除小鼠和過表達小鼠，結果表明angptl4通過改變血管通透性來抑制轉移性lewis肺癌細胞和b16f0黑色素瘤細胞的肺轉移。在一項研究中，證明腫瘤組織產(chǎn)生的angptl4與整合素α5β1，ve-鈣粘蛋白和claudin-5結合，它們是內皮粘附蛋白和緊密連接蛋白的主要成分，這個過程導致內皮細胞的破壞。在神經(jīng)膠質瘤模型中，敲除angptl4抑制了腫瘤生長和血管生成。在動脈粥樣硬化模型中抑制angptl4也可減輕病情。此外，最近的研究表明，angptl4還參與調節(jié)炎癥信號傳導。在angptl4敲除小鼠的肝臟中觀察到中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤。當前的研究表明angptl4以自分泌/旁分泌方式與整合素和/或nrp結合，隨后激活fak、src、rac1、profilin-1和rhoa活性，從而進一步激活pi3k/akt、jak/stat3、erk和nf-κb信號通路，這些作用促進炎癥并介導組織破壞。以上研究均表明angptl4可能通過內皮細胞在血管通透性、血管生成及炎癥反應中起重要作用。

3、申請?zhí)枮?02210710127.7的專利提出了一種嵌合抗原受體巨噬細胞及其制備方法和應用，該專利將編碼嵌合抗原受體的多核苷酸序列的核酸或載體導入小鼠骨髓來源巨噬細胞中，用于血液瘤或實體瘤等腫瘤治療。然而，該專利技術所構建的嵌合抗原受體巨噬細胞的細胞外結構域不具備靶向性，且小鼠骨髓來源巨噬細胞較難獲得，操作難度大。

4、申請?zhí)枮?02211401400.4的專利提供了一種靶向人her2的car，該car結構包括前導肽、胞外識別區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內信號域。其中，胞外識別區(qū)采用結合腫瘤抗原的單鏈抗體，跨膜區(qū)選擇能夠激活巨噬細胞吞噬信號的fcγrⅰ、fcγrⅱ、fcγrⅲ、fcer1g、cd36中的任意一種，胞內信號域則采用特定的p2結構域。利用上述car基因和重組載體，制備嵌合抗原受體修飾的巨噬細胞。然而該專利是基于her2陽性細胞設計的嵌合抗原受體，主要用于清除衰老細胞。

5、綜上，現(xiàn)有技術中還沒有人將嵌合抗原受體應用于血管疾病領域。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明是為了解決上述問題而進行的，目的在于提供一種靶向angptl4的嵌合抗原受體巨噬細胞及其制備方法和應用。

2、本發(fā)明提供了一種靶向angptl4的嵌合抗原受體，具有這樣的特征，包括：順序連接的細胞外結構域、鉸鏈區(qū)、跨膜結構域和細胞內結構域，其中，細胞外結構域包含靶向angptl4的單鏈可變片段，靶向angptl4的單鏈可變片段具有重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及連接肽，鉸鏈區(qū)為cd8鉸鏈區(qū)，跨膜結構域為cd8跨膜結構域，細胞內結構域為mertk。

3、在本發(fā)明提供的靶向angptl4的嵌合抗原受體中，還可以具有這樣的特征：其中，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seq?id?no:1，連接肽的氨基酸序列為seq?id?no:3，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seq?id?no:5，cd8鉸鏈區(qū)的氨基酸序列為seq?id?no:7，cd8跨膜結構域的氨基酸序列seq?id?no:9，mertk的氨基酸序列seq?id?no:11。

4、在本發(fā)明提供的靶向angptl4的嵌合抗原受體中，還可以具有這樣的特征：其中，重鏈可變區(qū)的編碼基因為seq?id?no:2，連接肽的編碼基因為seq?id?no:4，輕鏈可變區(qū)的編碼基因為seq?id?no:6，cd8鉸鏈區(qū)的編碼基因為seq?id?no:8，cd8跨膜結構域的編碼基因為seq?id?no:10，mertk的編碼基因為seq?id?no:12。

5、在本發(fā)明提供的靶向angptl4的嵌合抗原受體中，還可以具有這樣的特征，還包括：信號肽，其氨基酸序列為seq?id?no:13

6、在本發(fā)明提供的靶向angptl4的嵌合抗原受體中，還可以具有這樣的特征，還包括：信號肽，其編碼基因為seq?id?no14。

7、本發(fā)明還提供了一種表達載體，其特征在于，該表達載體為表達靶向angptl4的嵌合抗原受體的表達載體，該表達載體包含編碼上述嵌合抗原受體的編碼基因。

8、本發(fā)明還提供了一種病毒，其特征在于，包含上述表達載體。

9、本發(fā)明還提供了一種靶向angptl4的嵌合抗原受體巨噬細胞，其特征在于，其轉導有上述表達載體或上述病毒。

10、本發(fā)明還提供了一種angptl4的嵌合抗原受體巨噬細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1，設計靶向angptl4的嵌合抗原受體；步驟2，根據(jù)靶向angptl4的嵌合抗原受體構建表達載體；步驟3，基于表達載體進行病毒轉染并導入巨噬細胞。

11、本發(fā)明還提供了一種靶向angptl4的嵌合抗原受體巨噬細胞在干預血管疾病的產(chǎn)品中的應用。

12、在本發(fā)明提供的靶向angptl4的嵌合抗原受體巨噬細胞在干預血管疾病的產(chǎn)品中的應用中，還可以具有這樣的特征：其中，血管疾病包括主動脈夾層，靶向angptl4的嵌合抗原受體巨噬細胞能夠修復主動脈夾層。

13、發(fā)明的作用與效果

14、根據(jù)本發(fā)明涉及一種靶向angptl4的嵌合抗原受體巨噬細胞及其制備方法和應用。本發(fā)明設計了一種靶向angptl4的嵌合抗原受體包括順序連接的細胞外結構域、鉸鏈區(qū)、跨膜結構域和細胞內結構域，其中，細胞外結構域包含靶向angptl4的單鏈可變片段，靶向angptl4的單鏈可變片段具有重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的連接肽，鉸鏈區(qū)為cd8鉸鏈區(qū)，跨膜結構域為cd8跨膜結構域，細胞內結構域為mertk。將其借助特殊設計的質粒和病毒轉到入巨噬細胞中，構建了一種可靶向吞噬angptl4蛋白的嵌合抗原受體巨噬細胞。angptl4基因是血管生成及炎癥通路的重要樞紐，通過靶向吞噬其表達的angptl4蛋白可對血管疾病進行靶向干預。

15、進一步地，因為本發(fā)明使用raw264.7細胞系作為嵌合抗原受體的載體細胞，操作難度小，便于推廣應用。

16、經(jīng)試驗研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明首次將car技術應用于血管領域，且在主動脈夾層模型小鼠中療效顯著。