本發(fā)明涉及生物材料，具體涉及一種生產(chǎn)丁內(nèi)酰胺的工程改造菌。

背景技術(shù)：

1、丁內(nèi)酰胺被認(rèn)為是最重要的四碳分子之一，被美國(guó)能源部列為“生物質(zhì)合成中附加值最高的化學(xué)品”之一(werpy?and?petersen,2004)。丁內(nèi)酰胺可作為生產(chǎn)聚酰胺4(即尼龍4，pa4)的單體，與其他尼龍材料相比，pa4以其更高的熱穩(wěn)定性、更高的生物降解性和更強(qiáng)的防水性能而聞名(xu?et?al.,2017)。同時(shí)丁內(nèi)酰胺也是合成n-乙烯基吡咯烷酮的前體，n-乙烯基吡咯烷酮是用于注射藥品、其他藥品和進(jìn)行膜過濾的常用溶劑(lammens?etal.,2010；zhang?etal.,2016)。

2、目前常用的丁內(nèi)酰胺合成方法主要有三種：化學(xué)法、微生物化學(xué)結(jié)合法、微生物發(fā)酵法。市面上大部分內(nèi)酰胺類化學(xué)品是化學(xué)合成的，但由于化學(xué)生產(chǎn)中的環(huán)境污染，其原料為石油原料不可再生，且其反應(yīng)需高溫高壓，條件嚴(yán)格，所以能夠使用可再生能源對(duì)內(nèi)酰胺類產(chǎn)品進(jìn)行完全生物合成至關(guān)重要。目前，生物合成內(nèi)酰胺類的研究存在產(chǎn)量低、發(fā)酵條件嚴(yán)格等問題，距離投入工業(yè)應(yīng)用仍有較遠(yuǎn)距離。

3、由此，亟待提供一種兼顧高產(chǎn)量和低成本的生物合成定內(nèi)酰胺及其相關(guān)代謝物的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明至少?gòu)囊韵路矫娼鉀Q了相關(guān)技術(shù)的問題之一。

2、本發(fā)明第一方面的實(shí)施例提供一種工程改造菌，所述工程改造菌異源表達(dá)丁內(nèi)酰胺合成基因，其中所述丁內(nèi)酰胺合成基因選自由以下組成的組：β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因、肉堿輔酶a連接酶編碼基因和?；o酶a連接酶編碼基因。

3、在一些實(shí)施例中，所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因來源于丙酸梭菌并且所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如seq?id?no：3所示。

4、在一些實(shí)施例中，所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因來源于丙酸梭菌且未經(jīng)密碼子優(yōu)化，或者所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因來源于丙酸梭菌且經(jīng)過密碼子優(yōu)化。

5、在一些實(shí)施例中，所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因的核苷酸序列如seq?idno：1或如seq?id?no：2所示。

6、在一些實(shí)施例中，所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因來源于大腸桿菌并且所述肉堿輔酶a連接酶的氨基酸序列如seq?id?no：6所示。

7、在一些實(shí)施例中，所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因來源于大腸桿菌且未經(jīng)密碼子優(yōu)化，或者所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因來源于大腸桿菌且經(jīng)過密碼子優(yōu)化。

8、在一些實(shí)施例中，所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no：4或seq?id?no：5所示。

9、在一些實(shí)施例中，所述酰基輔酶a連接酶編碼基因來源于鏈霉菌并且所述?；o酶a連接酶的氨基酸序列如seq?id?no：9所示。

10、在一些實(shí)施例中，所述酰基輔酶a連接酶編碼基因來源于鏈霉菌且未經(jīng)密碼子優(yōu)化，或者所述酰基輔酶a連接酶編碼基因來源于鏈霉菌且經(jīng)過密碼子優(yōu)化。

11、在一些實(shí)施例中，所述酰基輔酶a連接酶編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no：7或seq?id?no：8所示。

12、在一些實(shí)施例中，所述丁內(nèi)酰胺合成基因是所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因或所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因，或者所述丁內(nèi)酰胺合成基因是所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因和所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因，

13、其中

14、所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因來源于丙酸梭菌且所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如seq?id?no：3所示，并且所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因來源于大腸桿菌且所述肉堿輔酶a連接酶的氨基酸序列如seq?id?no：6所示。

15、在一些實(shí)施例中，所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因來源于丙酸梭菌且未經(jīng)密碼子優(yōu)化，所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因來源于大腸桿菌且經(jīng)過密碼子優(yōu)化。

16、在一些實(shí)施例中，所述β-丙氨酸輔酶a轉(zhuǎn)移酶編碼基因的核苷酸序列如seq?idno：1所示，所述肉堿輔酶a連接酶編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no：5所示。

17、在一些實(shí)施例中，所述工程改造菌不表達(dá)一種或多種γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶。

18、在一些實(shí)施例中，所述工程改造菌不表達(dá)第一γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶，其中所述第一γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因?yàn)間abt1。

19、在一些實(shí)施例中，所述gabt1具有如seq?id?no：10所示的核苷酸序列。

20、在一些實(shí)施例中，所述工程改造菌不表達(dá)第二γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶，其中所述第二γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因?yàn)間abt2。

21、在一些實(shí)施例中，所述gabt2具有如seq?id?no：11所示的核苷酸序列。

22、在一些實(shí)施例中，所述工程改造菌不表達(dá)所述第一和第二γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶，其中所述第一γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因?yàn)間abt1，所述第二γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因?yàn)間abt2。

23、在一些實(shí)施例中，所述gabt1具有如seq?id?no：10所示的核苷酸序列，所述gabt2具有如seq?id?no：11所示的核苷酸序列。

24、在一些實(shí)施例中，所述工程改造菌的出發(fā)菌株為嗜鹽菌。

25、在一些實(shí)施例中，所述工程改造菌的出發(fā)菌株為鹽單胞菌。

26、在一些實(shí)施例中，所述鹽單胞菌選自由以下組成的組：halomonasbluephagenesis、halomonas?campaniensis和halomonas?aydingkolgenesis。

27、在一些實(shí)施例中，所述鹽單胞菌選自由以下組成的組：halomonasbluephagenesis?td1.0、halomonas?campaniensis?ls21和halomonas?aydingkolgenesism1。

28、在一些實(shí)施例中，所述丁內(nèi)酰胺合成基因在一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體上表達(dá)或者在所述工程改造菌的染色體上表達(dá)。

29、在一些實(shí)施例中，所述丁內(nèi)酰胺合成基因通過第一啟動(dòng)子在所述工程改造菌中進(jìn)行所述異源表達(dá)，其中所述第一啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所述組成型啟動(dòng)子包括porin58、porin221、porin194、porin68、porin42、porin140、porin141、porin278、porin226、porin3和porin211，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括iptg誘導(dǎo)型mmp1啟動(dòng)子。

30、本發(fā)明第二方面的實(shí)施例提供構(gòu)建上述第一方面任一實(shí)施例的工程改造菌的方法，包括：使所述丁內(nèi)酰胺合成基因在出發(fā)菌株中異源表達(dá)。

31、在一些實(shí)施例中，所述方法還包括：將出發(fā)菌株中的一種或多種γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因敲除。

32、本發(fā)明第三方面的實(shí)施例提供上述第一方面任一實(shí)施例的工程改造菌在生產(chǎn)選自由以下組成的組的代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用：蛋白類、核酸類、酸類、醇類、酯類產(chǎn)品和/或其它有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物。

33、在一些實(shí)施例中，所述代謝產(chǎn)物選自由以下組成的組：丁內(nèi)酰胺、尼龍材料、n-乙烯基吡咯烷酮和聚羥基脂肪酸酯。

34、與相關(guān)技術(shù)相比，本發(fā)明實(shí)施例至少實(shí)現(xiàn)了如下有益效果：

35、本發(fā)明實(shí)施例提供的工程改造菌能夠?qū)崿F(xiàn)以低成本底物碳源進(jìn)行丁內(nèi)酰胺及其與pha的聯(lián)產(chǎn)的生產(chǎn)平臺(tái)，能夠在無(wú)滅菌、開放和連續(xù)發(fā)酵條件下高效生產(chǎn)胞內(nèi)或胞外產(chǎn)品，不僅能夠降低生產(chǎn)成本，還易于擴(kuò)大規(guī)模、投入工業(yè)應(yīng)用。

36、采用本發(fā)明實(shí)施例提供的工程改造菌發(fā)酵生產(chǎn)丁內(nèi)酰胺及其相關(guān)產(chǎn)物，具有無(wú)需滅菌、設(shè)備簡(jiǎn)單和可以連續(xù)生產(chǎn)等特點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。