本發(fā)明屬于生物，涉及trx-sninj1融合蛋白及重組sninj1肽的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白1(nerve?injury-induced?protein?1，ninj1)這是一種位于細胞表面的黏附分子，包含1個胞外結(jié)構(gòu)域和2個跨膜結(jié)構(gòu)域。ninj1因最初在受損神經(jīng)末梢中被發(fā)現(xiàn)而得名，后來發(fā)現(xiàn)ninj1在許多炎癥性疾病中上調(diào)，包括多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎、動脈粥樣硬化等[pmid：24347169，22162058，30700695，31963519，32883094]。在病理條件下，基質(zhì)金屬蛋白酶9將巨噬細胞上的ninj1裂解，釋放出含ninj1的1-56aa的可溶性ninj1(sninj1)。有研究報道，在動脈粥樣硬化動物模型中，給予化學(xué)合成法制備的sninj1，可減少激活的巨噬細胞中的促炎基因的表達，減少單核細胞募集，進而緩解動脈粥樣硬化[pmid：32883094]。由于ninj1在多種炎癥性疾病中均上調(diào)，而sninj1所干預(yù)的機制在炎癥性疾病中往往都是導(dǎo)致疾病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，因此sninj1對于多種炎癥性疾病都可能成為一種非常有價值的免疫調(diào)節(jié)藥物。

2、目前，sninj1是采用化學(xué)合成法獲得，但是化學(xué)合成法具有下述缺點：工藝復(fù)雜且化學(xué)試劑有毒，合成過程中可能產(chǎn)生消旋體和發(fā)生副反應(yīng)，合成周期較長，且中長肽合成成本較高。

3、基因重組表達法采用基因工程的技術(shù)手段在原核或真核宿主中引入目標(biāo)基因表達元件，在宿主生物內(nèi)可以實現(xiàn)目標(biāo)肽的合成。重組表達法制備肽的過程中不會涉及有毒化學(xué)試劑及化學(xué)反應(yīng)的副反應(yīng)等問題。并且，使用原核宿主建立重組表達體系，可以利用廉價的原料經(jīng)發(fā)酵大量生產(chǎn)活性肽，如果有望成功，將會有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供trx-sninj1融合蛋白及重組sninj1肽的制備方法和應(yīng)用。

2、trx-sninj1融合蛋白是在大腸桿菌表達載體中克隆并表達的硫氧還蛋白trx與sninj1基因融合的融合蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3、重組sninj1肽是將trx-sninj1融合蛋白通過酶切去除trx標(biāo)簽的sninj1，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4、本發(fā)明提供的trx-sninj1融合蛋白及重組sninj1肽的制備方法，包括如下步驟：

5、步驟1，將含sninj1的編碼基因的基因片段插入載體質(zhì)粒，構(gòu)建表達質(zhì)粒；

6、步驟2，將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到表達菌；

7、步驟3，對表達菌使用iptg誘導(dǎo)表達，提取含目標(biāo)蛋白的破菌上清液，純化，獲得trx-sninj1融合蛋白；

8、步驟4，將上述trx-sninj1融合蛋白通過酶切切下trx標(biāo)簽，再將酶切后產(chǎn)物純化，去除trx標(biāo)簽和酶，獲得重組sninj1肽。

9、優(yōu)選的，步驟1中，所述表達質(zhì)粒為將含有sninj1編碼基因的核酸片段插入帶有trx標(biāo)簽的pet32a載體。其中，所述含有sninj1編碼基因的核酸片段包括用于插入載體的限制性酶切位點，tev酶切位點、sninj1編碼基因的核苷酸序列和終止密碼子如seq?id?no.3所示。

10、步驟2中，上述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)。

11、步驟3中，所述誘導(dǎo)表達條件為：iptg終濃度為0.01-1mm，誘導(dǎo)溫度為28-37℃，誘導(dǎo)時長為4-16h。

12、步驟4中，所述酶為具有高度的酶切位點特異性的tev酶，酶切條件為4℃反應(yīng)16h。酶切產(chǎn)物中帶有his標(biāo)簽的trx標(biāo)簽和tev酶，都通過與鎳柱結(jié)合而去除。

13、本發(fā)明還提供上述重組sninj1肽及trx-sninj1融合蛋白在免疫調(diào)節(jié)中的用途。

14、上述步驟制備的重組sninj1肽能下調(diào)lps誘導(dǎo)的巨噬細胞中促炎因子tnf-α、il-1β和il-6表達水平，具有免疫調(diào)節(jié)作用。

15、上述重組sninj1肽制備過程中的中間體trx-sninj1融合蛋白也能下調(diào)lps誘導(dǎo)的巨噬細胞中促炎因子tnf-α、il-1β和il-6表達水平，且與重組sninj1肽活性相當(dāng)，表明融合trx標(biāo)簽不影響sninj1的生物學(xué)功能，trx-sninj1融合蛋白可以直接作為藥物進行開發(fā)。

16、采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是：

17、1、本發(fā)明提供了具有免疫調(diào)節(jié)活性的原核表達體系生產(chǎn)的重組sninj1肽的制備方法，該方法簡單快捷、成本較低、無副反應(yīng)，彌補了當(dāng)前通過化學(xué)合成法制備sninj1的缺點。

18、2、trx-sninj1融合蛋白作為重組sninj1肽制備過程中的中間體，與重組sninj1肽在免疫調(diào)節(jié)功能上無顯著差異，可以直接作為藥物進行開發(fā)。

19、顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

20、以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

技術(shù)特征：

1.trx-sninj1融合蛋白，其特征在于：在大腸桿菌表達載體中克隆并表達的硫氧還蛋白trx與sninj1基因融合的融合蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.重組sninj1肽，其特征在于：通過將權(quán)利要求1所述trx-sninj1融合蛋白通過酶切去除trx標(biāo)簽的sninj1，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

3.權(quán)利要求1-2所述的trx-sninj1融合蛋白及重組sninj1肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

4.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟1中，所述重組表達質(zhì)粒為將含有sninj1編碼基因的核酸片段插入帶有trx標(biāo)簽的pet32a載體。其中，所述含有sninj1編碼基因的核酸片段包括用于插入載體的限制性酶切位點，tev酶切位點、sninj1編碼基因的核苷酸序列和終止密碼子，如seq?id?no.3所示。

5.權(quán)利要求2所述的重組sninj1肽在免疫調(diào)節(jié)中的用途。

6.權(quán)利要求1所述的trx-sninj1融合蛋白在免疫調(diào)節(jié)中的用途。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Trx?sNINJ1融合蛋白及重組sNINJ1肽的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明將含有sNINJ1編碼基因的核酸片段插入帶有Trx標(biāo)簽的pET32a載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達Trx?sNINJ1融合蛋白；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達和純化，獲得Trx?sNINJ1融合蛋白；再通過酶切去除Trx標(biāo)簽，獲得重組sNINJ1肽。重組sNINJ1肽和Trx?sNINJ1融合蛋白均有免疫調(diào)節(jié)作用，且活性相當(dāng)。本發(fā)明提供的制備方法簡單快捷、成本較低、無副反應(yīng)，得到的重組sNINJ1肽及其制備過程中的中間體Trx?sNINJ1融合蛋白均可作為藥物進行開發(fā)。

技術(shù)研發(fā)人員：趙佳瑩,萬琳,楊浩
受保護的技術(shù)使用者：四川大學(xué)華西醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15