本發(fā)明涉及分子診斷生物學(xué)，特別涉及一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、目前，市面上的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒大部分均為液體型，且均需在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中使用冷鏈運(yùn)輸?shù)姆绞奖M可能保證試劑盒的性能不受影響。而冷鏈運(yùn)輸不僅成本高，而且環(huán)境溫度的變化會(huì)直接影響檢測(cè)試劑的性能和有效期。所以，在保證試劑盒的性能不受影響的前提下，如何實(shí)現(xiàn)更方便更安全的對(duì)試劑盒進(jìn)行存儲(chǔ)和運(yùn)輸，同時(shí)解決運(yùn)輸高成本的問(wèn)題，成了大眾所面臨的難題。另一方面，市面上的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒一般為多管反應(yīng)液，在配液等環(huán)節(jié)給終端用戶增加了額外實(shí)驗(yàn)操作步驟，需提前將多管反應(yīng)液按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體系配制，使得整體實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)較為繁瑣。

2、因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球及其制備方法，旨在解決背景技術(shù)中所提到的現(xiàn)有新型冠狀病毒核酸檢測(cè)所存在的技術(shù)問(wèn)題。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球，包括新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)n基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第一上游引物、第一下游引物和第一探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)orf1?ab基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第二上游引物、第二下游引物和第二探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)s基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第三上游引物、第三下游引物和第三探針，特異性的人源管家基因rnase?p的第四上游引物、第四下游引物和第四探針，反應(yīng)緩沖液，ung酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，dna聚合酶，凍干保護(hù)劑和depc水。

4、在本發(fā)明第一方面一種可選的實(shí)施方式中，所述第一上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述第一探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

5、所述第二上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，所述第二探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

6、所述第三上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，所述第三下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.8所示，所述第三探針的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；

7、所述第四上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.10所示，所述第四下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.11所示，所述第四探針的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。

8、在本發(fā)明第一方面一種可選的實(shí)施方式中，所述第一探針的5’端使用第一報(bào)告熒光染料修飾，3’端使用第一淬滅熒光染料修飾；所述第二探針的5’端使用第二報(bào)告熒光染料修飾，3’端使用第二淬滅熒光染料修飾；所述第三探針的5’端使用第三報(bào)告熒光染料修飾，3’端使用第三淬滅熒光染料修飾；所述第四探針的5’端使用第四報(bào)告熒光染料修飾，3’端使用第四淬滅熒光染料修飾；

9、所述第一報(bào)告熒光染料、所述第二報(bào)告熒光染料、所述第三報(bào)告熒光染料和所述第四報(bào)告熒光染料均包括vi?c報(bào)告熒光染料、rox報(bào)告熒光染料、fam報(bào)告熒光染料和cy5報(bào)告熒光染料的任意一種，且所述第一報(bào)告熒光染料、所述第二報(bào)告熒光染料、所述第三報(bào)告熒光染料和所述第四報(bào)告熒光染料各不相同；

10、所述第一淬滅熒光染料、所述第二淬滅熒光染料、所述第三淬滅熒光染料和所述第四淬滅熒光染料均包括bhq1淬滅熒光染料、bhq2淬滅熒光染料和bhq3淬滅熒光染料的任意一種。

11、在本發(fā)明第一方面一種可選的實(shí)施方式中，所述凍干保護(hù)劑包括多聚物和醇類(lèi)；所述多聚物包括多糖和蛋白質(zhì)；所述多糖包括蔗糖、海藻糖、普魯蘭多糖和葡聚糖的一種或多種；所述醇類(lèi)包括甘露醇、肌醇、聚乙二醇的一種或多種；所述蛋白質(zhì)包括牛血清蛋白。

12、在本發(fā)明第一方面一種可選的實(shí)施方式中，所述凍干微球的粒徑為1-10mm，所述凍干微球凍干前試劑液滴的體積為10-40μl，所述凍干微球復(fù)溶時(shí)用10-40μl復(fù)溶水進(jìn)行溶解，模板添加量為1-10μl，擴(kuò)增時(shí)總反應(yīng)體積為11-40μl。

13、本發(fā)明第二方面提供了一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

14、基于新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球的配方表準(zhǔn)備好原料，所述原料包括新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)n基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第一上游引物、第一下游引物和第一探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)orf1?ab基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第二上游引物、第二下游引物和第二探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)s基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第三上游引物、第三下游引物和第三探針，特異性的人源管家基因rnase?p的第四上游引物、第四下游引物和第四探針，反應(yīng)緩沖液，ung酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，dna聚合酶，凍干保護(hù)劑和depc水；

15、將所述原料混合均勻得到混合液；

16、將所述混合液利用分液系統(tǒng)控制液滴，將所述液滴滴入液氮中，在所述液氮中冷卻后形成試劑微球；

17、將所述試劑微球在凍干機(jī)上進(jìn)行冷凍干燥，氮?dú)鈴?fù)壓后得到凍干微球。

18、在本發(fā)明第二方面一種可選的實(shí)施方式中，將所述試劑微球在凍干機(jī)上進(jìn)行冷凍干燥，氮?dú)鈴?fù)壓后得到凍干微球之后還包括：將所述凍干微球分裝到預(yù)置容器中，將所述容器置于密封袋中抽真空進(jìn)行保存，所述預(yù)置容器包括八連管。

19、在本發(fā)明第二方面一種可選的實(shí)施方式中，所述將所述原料混合均勻得到混合液包括：預(yù)先將所述凍干保護(hù)劑的各成分統(tǒng)一溶解于所述depc水中并定容至一定體積，獲得凍干保護(hù)劑溶液。

20、在本發(fā)明第二方面一種可選的實(shí)施方式中，在所述原料中，所述第一上游引物、所述第一下游引物、所述第一探針、所述第二上游引物、所述第二下游引物、所述第二探針、所述第三上游引物、所述第三下游引物、所述第三探針、所述第四上游引物、所述第四下游引物、所述第四探針在體系中的終濃度均在0.1-1μm之間。

21、有益效果：本發(fā)明公開(kāi)了一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球及其制備方法，其中，凍干微球包括新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)n基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第一上游引物、第一下游引物和第一探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)orf1?ab基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第二上游引物、第二下游引物和第二探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)s基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第三上游引物、第三下游引物和第三探針，特異性的人源管家基因rnase?p的第四上游引物、第四下游引物和第四探針，反應(yīng)緩沖液，ung酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，dna聚合酶，凍干保護(hù)劑和depc水。本發(fā)明的凍干微球能夠長(zhǎng)時(shí)間的室溫保存，試劑性能良好，簡(jiǎn)化現(xiàn)有液體型的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑配液過(guò)程的繁瑣操作，減少實(shí)驗(yàn)誤差和避免污染。

技術(shù)特征：

1.一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球，其特征在于，包括新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)n基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第一上游引物、第一下游引物和第一探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)orf1?ab基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第二上游引物、第二下游引物和第二探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)s基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第三上游引物、第三下游引物和第三探針，特異性的人源管家基因rnase?p的第四上游引物、第四下游引物和第四探針，反應(yīng)緩沖液，ung酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，dna聚合酶，凍干保護(hù)劑和depc水。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球，其特征在于，所述第一上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述第一探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球，其特征在于，所述第一探針的5’端使用第一報(bào)告熒光染料修飾，3’端使用第一淬滅熒光染料修飾；所述第二探針的5’端使用第二報(bào)告熒光染料修飾，3’端使用第二淬滅熒光染料修飾；所述第三探針的5’端使用第三報(bào)告熒光染料修飾，3’端使用第三淬滅熒光染料修飾；所述第四探針的5’端使用第四報(bào)告熒光染料修飾，3’端使用第四淬滅熒光染料修飾；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球，其特征在于，所述凍干保護(hù)劑包括多聚物和醇類(lèi)；所述多聚物包括多糖和蛋白質(zhì)；所述多糖包括蔗糖、海藻糖、普魯蘭多糖和葡聚糖的一種或多種；所述醇類(lèi)包括甘露醇、肌醇、聚乙二醇的一種或多種；所述蛋白質(zhì)包括牛血清蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球，其特征在于，所述凍干微球的粒徑在1-10mm之間，所述凍干微球凍干前試劑液滴的體積在10-40μl之間，所述凍干微球復(fù)溶時(shí)用10-30μl復(fù)溶水進(jìn)行溶解，模板添加量為1-10μl，擴(kuò)增時(shí)總反應(yīng)體積為11-40μl。

6.一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球的制備方法，其特征在于，將所述試劑微球在凍干機(jī)上進(jìn)行冷凍干燥，氮?dú)鈴?fù)壓后得到凍干微球之后還包括：將所述凍干微球分裝到預(yù)置容器中，將所述容器置于密封袋中抽真空進(jìn)行保存，所述預(yù)置容器包括八連管。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球的制備方法，其特征在于，所述將所述原料混合均勻得到混合液包括：預(yù)先將所述凍干保護(hù)劑的各成分統(tǒng)一溶解于所述depc水中并定容至一定體積，獲得凍干保護(hù)劑溶液。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球的制備方法，其特征在于，在所述原料中，所述第一上游引物、所述第一下游引物、所述第一探針、所述第二上游引物、所述第二下游引物、所述第二探針、所述第三上游引物、所述第三下游引物、所述第三探針、所述第四上游引物、所述第四下游引物、所述第四探針在體系中的終濃度均在0.1-1μm之間。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型冠狀病毒核酸檢測(cè)用凍干微球及其制備方法，其中，凍干微球包括新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)N基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第一上游引物、第一下游引物和第一探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)ORF1ab基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第二上游引物、第二下游引物和第二探針，新型冠狀病毒特異性靶標(biāo)S基因區(qū)域設(shè)計(jì)的第三上游引物、第三下游引物和第三探針，特異性的人源管家基因RNase?P的第四上游引物、第四下游引物和第四探針，反應(yīng)緩沖液，UNG酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA聚合酶，凍干保護(hù)劑和DEPC水。本發(fā)明的凍干微球能夠長(zhǎng)時(shí)間的室溫保存，試劑性能良好，簡(jiǎn)化現(xiàn)有液體型的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑配液過(guò)程的繁瑣操作，減少實(shí)驗(yàn)誤差和避免污染。

技術(shù)研發(fā)人員：胡美玲,申耘,田潔
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳市朗瑞生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15