本發(fā)明涉及基因工程，尤其涉及一種外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜?？购敌灾械膽?yīng)用。

背景技術(shù)：

1、紫花苜蓿(medicago?satival.)，豆科草本，栽培種多為同源四倍體。紫花苜蓿是長日照植物，喜半濕潤到半干旱氣候，苗期生長緩慢。紫花苜蓿不僅在畜牧業(yè)占據(jù)一席之地，還解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境治理等過程中出現(xiàn)的難題，“牧草之王”紫花苜蓿以其高蛋白，高產(chǎn)量，穩(wěn)居優(yōu)質(zhì)牧草之列。近年來，苜蓿已成為我國綜合耕作、放牧、生態(tài)保護(hù)等應(yīng)用最廣泛的草種。而根據(jù)全國畜牧總站發(fā)布的信息，紫花苜蓿主要種植于我國甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏等長江以北的干旱、半干旱區(qū)域，其生長過程中普遍遭受干旱脅迫，嚴(yán)重干旱影響紫花苜蓿的生物積累，不僅導(dǎo)致其產(chǎn)量減少，還降低其質(zhì)量。在田間自然條件下，干旱減少紫花苜蓿葉、芽和根的干物質(zhì)，其中地上部分受到的影響更大，減產(chǎn)更多；紫花苜蓿營養(yǎng)元素如磷、鈣、鎂和氮含量，和細(xì)胞壁成分的濃度如中性洗滌劑纖維、酸性洗滌劑纖維和酸性洗滌劑木質(zhì)素含量都因此降低。紫花苜蓿大多種植于干旱半干旱地區(qū)，需要人工灌溉補(bǔ)水才能保證其產(chǎn)量與品質(zhì)，水資源愈發(fā)匱乏，嚴(yán)重影響著苜蓿的產(chǎn)量和質(zhì)量，為了保證優(yōu)質(zhì)牧草的產(chǎn)量，增強(qiáng)紫花苜蓿的耐旱性迫在眉睫。

2、自從上世紀(jì)80年代，一氧化氮理論被授予諾貝爾獎(jiǎng)后，no的潛在功能被廣泛研究，解釋了大量科學(xué)問題。例如，外源no可促進(jìn)大豆生成不定根，改善香蕉葉片的萎蔫黃化，以增加干旱脅迫下植物的養(yǎng)分積累和產(chǎn)量，正向調(diào)節(jié)植物的防御機(jī)制來承受有限的水條件。no可降低干旱引起的不正常增加的氣孔導(dǎo)度，從而使蒸騰速率趨于平衡，降低葉片失水率、維持葉片水勢和提高水分利用效率來抵御干旱脅迫。在紫花苜蓿、大豆、小麥、玉米等植物中發(fā)現(xiàn)，外源no可有效增強(qiáng)干旱脅迫下的sod酶、cat酶、apl酶等抗氧化酶活性，減少mda、脯氨酸、過氧化氫等氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，促進(jìn)總酚、生育酚等次生代謝物的生成來激活強(qiáng)效抗氧化系統(tǒng)，維持自由基ros的平衡水平，從而削弱干旱對高水平ros的誘導(dǎo)，減輕氧化損傷，維持植物細(xì)胞器的正常功能，同時(shí)緩解干旱引起的水分損失和離子泄露。分子水平上，植物通過膜上的傳感器感知外部干旱刺激，并通過no在內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將它們沿信號傳輸。

3、盡管no已經(jīng)在各種植物中展開研究，但在苜蓿中的研究仍然較少，特別是耐旱方面。此外，目前已經(jīng)利用rna-seq測序技術(shù)分析了干旱脅迫下外源no響應(yīng)的mirna，并鑒定出屬于46個(gè)家族的90個(gè)已知mirna，并預(yù)測了177個(gè)新的mirna，而對于其中某一mirna的鑒定與功能研究頗少。目前一般認(rèn)為mirna是單鏈20-24nt左右的內(nèi)源非編碼rna，主要通過轉(zhuǎn)錄后翻譯發(fā)揮功能，幾乎參與植物所有的發(fā)育過程。于2020年鑒定干旱處理和預(yù)施外源no再干旱處理下紫花苜蓿“三得利”mirna的表達(dá)，在peg和peg+snp樣品中分別鑒定出32個(gè)和55個(gè)差異表達(dá)的mirna，其中mir166s對no和干旱響應(yīng)都十分顯著，這些大規(guī)模測序?yàn)楹Y選并表征響應(yīng)干旱脅迫的基因、mirna的功能提供了有價(jià)值的信息。

4、隨著對紫花苜蓿mirna的高通量測序的大規(guī)模展開，對某一mirna的生物學(xué)功能的鑒定也逐漸成為一大熱點(diǎn)。mir166不僅在植物生長發(fā)育過程起著關(guān)鍵作用，還在調(diào)節(jié)植物對生物和非生物脅迫的耐受過程起著重要作用，在鷹嘴豆中發(fā)現(xiàn)mir166s在干旱后上調(diào)表達(dá)，具有組織特異性。水稻中過表達(dá)mir166則表現(xiàn)為卷葉、木質(zhì)部直徑減小，表現(xiàn)出較高的耐旱性。玉米sttm166通過葉片卷曲、葉基部變脆、晚開花等形態(tài)發(fā)育，增加aba水平，降低iaa水平以調(diào)節(jié)玉米對干旱脅迫的耐受性。目前在已發(fā)現(xiàn)在gma-sttm166植株中mir166通路調(diào)節(jié)aba信號通路基因，而mir166靶基因athb-14-like則直接激活一些基因，同時(shí)mir166和靶基因反饋調(diào)節(jié)，可在不影響產(chǎn)量的前提下賦予大豆耐旱性。

5、鑒于mir166在植物抗旱中的重要功能，且在外源no介導(dǎo)下紫花苜蓿mir166響應(yīng)干旱脅迫中的功能分析還未見報(bào)道，故本試驗(yàn)以“三得利”紫花苜蓿為材料，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速獲得穩(wěn)定遺傳的msa-mir166過表達(dá)株系與沉默株系，以探究在外源no介導(dǎo)下紫花苜蓿mir166響應(yīng)干旱脅迫中的功能，為快速培育穩(wěn)定遺傳的耐旱苜紫花蓿尋找合適的mirna。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜蓿抗旱性中的應(yīng)用，在紫花苜蓿通過外源no介導(dǎo)沉默mir166-5p株系，提高植株的抗干旱性能。

2、本發(fā)明提供一種外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜?？购敌灾械膽?yīng)用，所述外源no介導(dǎo)的mir166-5p用于提高紫花苜蓿的抗旱性能。

3、根據(jù)本發(fā)明提供的外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜?？购敌灾械膽?yīng)用，所述mir166-5p的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

4、根據(jù)本發(fā)明提供的外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜?？购敌灾械膽?yīng)用，所述mir166-5p的表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化方法包括以下步驟：

5、s1、利用sttm技術(shù)構(gòu)建抑制表達(dá)載體；

6、s2、利用人工mirna技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)載體；

7、s3、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化與組培；

8、s4、mir166e-5p過表達(dá)與沉默植株的鑒定。

9、根據(jù)本發(fā)明提供的外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜蓿抗旱性中的應(yīng)用，s1中所述利用sttm技術(shù)構(gòu)建抑制表達(dá)載體包括以下步驟：

10、s11、引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增；

11、s12、mir166e-5p與sttm沉默載體的重組連接；

12、s13、重組質(zhì)粒pbwa(v)hs-sttm-mir166e-5p轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

13、根據(jù)本發(fā)明提供的外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜?？购敌灾械膽?yīng)用，s11中所述引物分別為sttm-mir166e-5p-pf和sttm-mir166e-5p-pr，所述sttm-mir166e-5p-pf和sttm-mir166e-5p-pr的核苷酸序列分別如seq?id?no:3和seq?id?no:4所示，所述目的片段擴(kuò)增得到sttm-mir166e-5p。

14、根據(jù)本發(fā)明提供的外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜?？购敌灾械膽?yīng)用，s12中所述mir166e-5p與sttm沉默載體的重組連接包括以下步驟：

15、s121、酶切反應(yīng)；

16、s122、酶連反應(yīng)；

17、s123、酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)；

18、s124、大腸桿菌菌液pcr。

19、根據(jù)本發(fā)明提供的外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜蓿抗旱性中的應(yīng)用，s2中所述利用人工mirna技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)載體包括以下步驟：

20、s21、引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增；

21、s22、前體d片段的克??；

22、s23、前體d片段與過表達(dá)載體的連接；

23、s24、重組子pcpbi121-amir166e-5p轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

24、根據(jù)本發(fā)明提供的外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜?？购敌灾械膽?yīng)用，s21中所述引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增包括以下步驟：

25、s211、引物設(shè)計(jì)；

26、s212、prs300質(zhì)粒的提取；

27、s213、amir166e-5p前體片段的擴(kuò)增。

28、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

29、本發(fā)明提供一種外源no介導(dǎo)的mir166-5p在提高紫花苜?？购敌灾械膽?yīng)用，紫花苜蓿經(jīng)過外源no介導(dǎo)制備得到mir166-5p沉默株系，沉默株系在外源no介導(dǎo)下耐旱性能良好，干旱后失水率降低、抗氧化酶活性增加、氧化產(chǎn)物增量降低、葉綠體色素含量降幅減少以及脯氨酸含量變化較小，同時(shí)沉默株系在no介導(dǎo)下響應(yīng)干旱的各靶基因表達(dá)水平升高，在no介導(dǎo)下no合酶基因響應(yīng)干旱的水平升高。