本發(fā)明屬于植物基因工程，具體涉及梨轉(zhuǎn)錄因子pbrwhy2基因的功能及其應(yīng)用。本發(fā)明從‘碭山酥梨’花粉克隆得到轉(zhuǎn)錄因子pbrwhy2基因，通過(guò)反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染(odn)和花粉磁轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)表明，pbrwhy2促進(jìn)花粉管頂端活性氧(ros)水平和纖維素含量的變化，進(jìn)而促進(jìn)梨花粉管的生長(zhǎng)。進(jìn)一步的分析表明，pbrwhy2通過(guò)響應(yīng)自我s-rnase，靶向激活pbragp16、pbrralf6和pbrgis1的轉(zhuǎn)錄。

背景技術(shù)：

1、自交不親和性(si)是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展起來(lái)的一種保護(hù)遺傳多樣性的復(fù)雜機(jī)制(mcclure?et?al.,2011)。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多非s因素參與了si反應(yīng)。肌醇加氧酶(cgmiox3)通過(guò)提高表達(dá)水平和增強(qiáng)活性來(lái)響應(yīng)s-rnase酶進(jìn)入花粉管發(fā)出的si信號(hào)，然后通過(guò)催化肌醇的降解來(lái)促進(jìn)asa的合成(xu?et?al.,2024)。prmpk9-1是花粉中si的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在程序性細(xì)胞死亡的上游起作用，涉及肌動(dòng)蛋白和devdase的激活(chai?etal.,2017)。s-rnase和可溶性無(wú)機(jī)焦磷酸酶(mdppa)之間的物理相互作用抑制了其活性，導(dǎo)致花粉管生長(zhǎng)減少(li?et?al.,2018)。同樣，許多轉(zhuǎn)錄因子也參與了si反應(yīng)。自我s-rnase可以通過(guò)限制pbabf.d.2-pblrxa2.1/pblrxa2.2信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)阻止花粉管的生長(zhǎng)(wu?etal.，2023a)。s-rnase降低了pbcob的表達(dá)，是通過(guò)降低其上游因子pbc2h2.k16.2的表達(dá)來(lái)阻止花粉管的生長(zhǎng)(wuet?al.，2023b)。

2、why家族包含一個(gè)特征性的“旋轉(zhuǎn)”二級(jí)結(jié)構(gòu)和一個(gè)保守的“kgkaal”dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。why最初被鑒定為一種名為p24的因子，在卵菌病原體感染期間充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子(despres?et?al.,1995；desveaux?et?al.,2000)。大多數(shù)植物都有兩種why蛋白，why1和why2。why1是一種核定位蛋白。why2靶向線粒體，但有證據(jù)表明它定位于細(xì)胞核。在擬南芥中只發(fā)現(xiàn)了第三種蛋白質(zhì)，位于葉綠體中(huang?et?al.,2020；krause?et?al.,2005)。why2在維持線粒體dna的完整性方面起著至關(guān)重要的作用，也與保護(hù)線粒體dna在花粉發(fā)育過(guò)程中不被降解有關(guān)(cai?et?al.,2015)。在細(xì)胞核中，why2與編碼蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的sweet11/15基因的啟動(dòng)子結(jié)合。它還增加了參與茉莉酸信號(hào)和相關(guān)防御反應(yīng)的基因的表達(dá)(huang?et?al.,2020)。因此，why2對(duì)植物細(xì)胞器和細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要。然而，why2在花粉管生長(zhǎng)和si反應(yīng)中的潛在作用尚未得到很大程度的探索。

3、梨是深受百姓喜愛(ài)的水果，成功授粉受精是保證梨產(chǎn)量的關(guān)鍵。本研究獲得了梨花粉中的轉(zhuǎn)錄因子pbrwhy2基因，并且研究其對(duì)梨花粉管生長(zhǎng)的影響和在梨自交不親和過(guò)程中所起到的作用。探索花粉磁轉(zhuǎn)染技術(shù)并將其應(yīng)用到實(shí)際中，可以很大程度上降低人工授粉成本，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也具有相當(dāng)重要的理論和實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供pbrwhy2基因或與所述pbrwhy2基因相關(guān)的生物材料在促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)pbrwhy2基因或與所述pbrwhy2基因相關(guān)的生物材料在如下(a1)-(a9)中的至少一種應(yīng)用：

4、(a1)在促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)中的應(yīng)用；

5、(a2)在制備促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)產(chǎn)品中的應(yīng)用；

6、(a3)在提高梨花粉管頂端ros水平中的應(yīng)用；

7、(a4)在制備提高梨花粉管頂端ros水平產(chǎn)品中的應(yīng)用；

8、(a5)在提高梨花粉管頂端纖維素含量中的應(yīng)用；

9、(a6)在制備提高梨花粉管頂端纖維素含量產(chǎn)品中的應(yīng)用；

10、(a7)在緩解梨自我s-rnase毒性方面的應(yīng)用；

11、(a8)在提高梨體外授粉效率中的應(yīng)用；

12、(a9)在制備提高梨體外授粉效率產(chǎn)品中的應(yīng)用；

13、所述的pbrwhy2基因?yàn)槿缦?b1)-(b3)中的任意一種dna分子：

14、(b1)編碼區(qū)包括如seq?id?no.1所示核苷酸序列的dna分子；

15、(b2)核苷酸序列如seq?id?no.1所示的dna分子；

16、(b3)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的dna序列雜交且編碼與促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的dna分子。

17、進(jìn)一步，上述的應(yīng)用中所述的與pbrwhy2基因相關(guān)的生物材料為如下(c1)-(c6)中的至少一種：

18、(c1)所述pbrwhy2基因編碼的蛋白；

19、(c2)含有所述pbrwhy2基因的表達(dá)盒；

20、(c3)含有所述pbrwhy2基因的重組載體、或含有(c2)所述表達(dá)盒的重組載體；

21、(c4)含有所述pbrwhy2基因的重組微生物、或含有(c2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有(c3)所述重組載體的重組微生物；

22、(c5)含有所述pbrwhy2基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有(c2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有(c3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

23、(c6)含有所述pbrwhy2基因的磁轉(zhuǎn)染試劑、或含有(c2)所述表達(dá)盒的磁轉(zhuǎn)染試劑、或含有(c3)所述重組載體的磁轉(zhuǎn)染試劑。

24、更進(jìn)一步，所述pbrwhy2基因編碼的蛋白是如下(d1)或(d2)或(d3)：

25、(d1)氨基酸序列如seq?id?no.2所示的蛋白質(zhì)；

26、(d2)將seq?id?no.2所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)相關(guān)的由seq?id?no.2衍生的蛋白質(zhì)；

27、(d3)將(d1)或(d2)的n末端或/和c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)。

28、進(jìn)一步，將所述的pbrwhy2基因在梨花粉管中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)，促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)或/和提高梨花粉管頂端ros水平或/和纖維素含量。更進(jìn)一步，利用磁轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)技術(shù)體外處理梨花粉將所述的pbrwhy2基因在梨花粉管中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。

29、第二方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)一種促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)的方法，將前述的pbrwhy2基因在梨花粉管中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)，促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)。

30、第三方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)一種提高梨花粉管頂端ros水平或/和纖維素含量的方法，將前述的pbrwhy2基因在梨花粉管中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)，提高梨花粉管頂端ros水平或/和纖維素含量。

31、第四方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)一種緩解梨自我s-rnase毒性的方法，將前述的pbrwhy2基因在梨花粉管中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)，緩解梨自我s-rnase引起的花粉管生長(zhǎng)受到抑制，花粉管尖端ros水平降低，花粉管纖維素含量變少的特性。

32、進(jìn)一步，上述的方法中，利用磁轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)技術(shù)體外處理梨花粉將所述的pbrwhy2基因在梨花粉管中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。更進(jìn)一步，所述磁轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)技術(shù)具體包括以下步驟：

33、(1)設(shè)計(jì)引物pcr擴(kuò)增pbrwhy2基因，將所述的pbrwhy2基因插入到lat52::gfp載體的xbai和bamhi的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pbrwhy2-lat52::gfp；

34、(2)將轉(zhuǎn)染試劑和所述的重組質(zhì)粒pbrwhy2-lat52::gfp混合制備/pbrwhy2-lat52::gfp轉(zhuǎn)染試劑，采用所述的

35、/pbrwhy2-lat52::gfp轉(zhuǎn)染試劑處理花粉細(xì)胞。

36、本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從‘碭山酥梨’花粉中鑒定、克隆得到的功能基因pbrwhy2在促進(jìn)梨花粉管生長(zhǎng)方面的應(yīng)用以及pbrwhy2在緩解自我s-rnase毒性的應(yīng)用。本發(fā)明利用植物基因克隆技術(shù)從‘碭山酥梨’花粉中克隆得到基因pbrwhy2，該基因?qū)儆趙hirly型轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)odn和花粉磁轉(zhuǎn)染試驗(yàn)體外處理‘碭山酥梨’花粉，結(jié)果顯示pbrwhy2能積極地促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)，同時(shí)pbrwhy2表達(dá)的變化與花粉管頂端ros水平和纖維素含量的變化有關(guān)。此外，pbrwhy2也參與自交不親和反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，靶向激活下游基因pbragp16、pbrralf6和pbrgis1的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明采用花粉磁轉(zhuǎn)染技術(shù)研究花粉管中基因的功能，為提高授粉效率方面提供了廣闊的應(yīng)用前景。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有優(yōu)點(diǎn)和效果：

38、(1)pbrwhy2基因的發(fā)現(xiàn)，為提高梨體外授粉效率提供了新的思路，降低勞動(dòng)成本，為實(shí)施綠色農(nóng)業(yè)提供新途徑。

39、(2)與傳統(tǒng)的花粉基因槍技術(shù)相比，通過(guò)花粉磁轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)花粉管基因的方法，具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)便、節(jié)約成本、可定向改良性狀等優(yōu)點(diǎn)。