本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體涉及一種黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、黃瓜（ cucumis?sativus?l.）在我國(guó)種植面積較大，據(jù)統(tǒng)計(jì)2021年底我國(guó)的栽培面積已經(jīng)達(dá)到1900多萬畝，產(chǎn)量高達(dá)7560萬噸，占據(jù)全球黃瓜總產(chǎn)量的八成。隨著全球氣候變化和農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，黃瓜病毒病在黃瓜各個(gè)產(chǎn)區(qū)逐年加重。目前，世界范圍內(nèi)植物病毒現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)700多種，危害147種作物，僅蔬菜上就發(fā)現(xiàn)80多種。近年來，在我國(guó)黃瓜上先后報(bào)道有西瓜銀斑駁病毒（watermelon?silver?mottle?virus，wsmov）、瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit?chlorotic?yellows?virus，ccyv）、甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒（melon?necrotic?spotvirus,?mnsv）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber?green?mottle?mosaic?virus，cgmmv）等病毒為害，造成嚴(yán)重影響和經(jīng)濟(jì)損失。

2、2024年在調(diào)查天津武清、北辰等地區(qū)黃瓜病毒病發(fā)生情況過程中，發(fā)現(xiàn)黃瓜葉片畸形、皺縮、褪綠、黃化、花葉等病毒病癥狀嚴(yán)重，據(jù)此對(duì)黃瓜病毒病的毒源種類及其復(fù)合侵染情況進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)黃瓜病毒病復(fù)合侵染情況嚴(yán)重，且檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃瓜受到黃瓜葉斑病毒（cucumber?leaf?spot?virus，clsv）和黃瓜保加利亞潛隱病毒（cucumber?bulgariaenselatent?virus，cblv）侵染的問題（見圖1）。

3、黃瓜葉斑病毒（cucumber?leaf?spot?virus，clsv）屬于 tombusviridae科中的 aureusvirus屬，該病毒在植物中會(huì)引起局部和系統(tǒng)性的感染，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致葉片上出現(xiàn)局部壞死病變?。黃瓜葉斑病毒的檢測(cè)通常采用病毒特異性雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（das-elisa）。通過采集葉片樣本并進(jìn)行酶聯(lián)檢測(cè)，可以檢測(cè)到該病毒的存在。當(dāng)植物汁液用于機(jī)械接種健康的植物時(shí)，接種后20天~25天內(nèi)會(huì)在葉片上觀察到病變斑，有時(shí)伴有壞死中心?。黃瓜葉斑病毒病在伊朗、波蘭等國(guó)家和地區(qū)都有報(bào)道，如在伊朗的黃瓜、甜瓜和西葫蘆上檢測(cè)到黃瓜葉斑病毒的存在。此外，在波蘭的溫室黃瓜上也發(fā)現(xiàn)該病毒，導(dǎo)致黃瓜植株出現(xiàn)矮化和延遲開花等癥狀。

4、黃瓜保加利亞潛隱病毒（cucumber?bulgariaense?latent?virus，cblv）屬于 tombusviridae科中的 tombusvirus屬。cblv于2003年在保加利亞首次報(bào)道，并被確認(rèn)為 tombusvirus屬的新成員。2015年報(bào)道cblv在伊朗再次被發(fā)現(xiàn)，2020年cblv在中國(guó)臺(tái)灣被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，目前這些cblv分離物均來自黃瓜。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)cblv與瓜類褪綠病毒（ccyv）、西瓜銀斑駁病毒（wsmov）復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

5、生產(chǎn)上蔬菜容易受到病蟲害等的侵染，給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的威脅。病毒病存在潛伏侵染現(xiàn)象，一旦出現(xiàn)癥狀則難于防治，造成病毒病爆發(fā)給蔬菜生產(chǎn)帶來嚴(yán)重影響。病毒可以通過種子、汁液、傳毒介體和土壤及病殘?bào)w等傳播，因此如何在早期鑒別植株、種子、傳毒介體、土壤及病殘?bào)w是否攜帶病毒至關(guān)重要。據(jù)此，我們開發(fā)了一種黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法。該檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，操作便捷，具有快速、特異、靈敏度高的特點(diǎn)，具廣泛應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法。通過設(shè)計(jì)黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒基因的特異引物，建立黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒的雙重rt-pcr檢測(cè)方法，為方便、快速、有效地檢測(cè)待測(cè)樣本是否攜帶黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒提供技術(shù)支撐。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明首先提供了一種用于黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒的雙重rt-pcr檢測(cè)引物基因組，其特征在于：所述檢測(cè)引物組為clsv-pri-f/r引物對(duì)和cblv-pri-f3904/r4573引物對(duì)：

4、clsv-pri-f/r引物對(duì)：

5、正向引物序列clsv-pri-f：5'-ataagacaaccaaagccatactacc-3'，seq?id?no.1；

6、反向引物序列clsv-pri-r：5'-cataacagacttcactctggacaac-3'，seq?id?no.2；

7、cblv-pri-f3904/r4573引物對(duì)：

8、正向引物序列cblv-pri-f3904：5'-atccccttggtttcaaggaaa?-3'，seq?id?no.3；

9、反向引物序列cblv-pri-r4573：5'-ctgcctttcggcaatgttccgg-3'，，seq?id?no.4。

10、同時(shí)，本發(fā)明還規(guī)定了雙重rt-pcr檢測(cè)引物基因組，所述clsv-pri-f/r引物對(duì)和cblv-pri-f3904/r4573引物對(duì)的摩爾濃度比分別為4：（4~6）或5：（4~6）或6：（4~6），并提出一種用于檢測(cè)黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒的檢測(cè)試劑盒，包含任一所述的雙重rt-pcr檢測(cè)引物組。

11、其次，本發(fā)明還提供了一種黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒的雙重rt-pcr檢測(cè)方法：首先提取待測(cè)樣本的總rna，通過反轉(zhuǎn)錄成cdna，然后以反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板，以權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物組作為引物進(jìn)行雙重rt-pcr擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行判斷，確定待測(cè)樣本是否攜帶黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒。

12、黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒的雙重rt-pcr檢測(cè)方法，具體包括以下步驟：

13、s1.?提取待測(cè)樣本的總rna；

14、s2.?將步驟s1提取的待測(cè)樣本總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna；

15、s3.?以步驟s2所得cdna為模板，采用權(quán)利要求1~4任一所述雙重rt-pcr檢測(cè)引物組進(jìn)行雙重rt-pcr擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

16、s4.?根據(jù)凝膠電泳檢測(cè)的dna圖譜進(jìn)行結(jié)果判定，若擴(kuò)增出333bp的特異dna條帶，則表示待測(cè)樣本攜帶黃瓜葉斑病毒，若擴(kuò)增出669bp的特異dna條帶，則表示待測(cè)樣本攜帶黃瓜保加利亞潛隱病毒，若未擴(kuò)增出特異dna條帶，則表示待測(cè)樣本不攜帶黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒。

17、雙重rt-pcr的反應(yīng)體系總體積含有以下分?jǐn)?shù)的各組分：cdna模板1份～3份，transtaq?mix?12.5份，10μmol/lclsv-pri-f?0.8份~1.2份，10μmol/lcblv-pri-f3904?0.8份~1.2份，10μmol/lclsv-pri-r?0.8份~1.2份，10?μmol/lcblv-pri-r4573?0.8份~1.2份，ddh2o?4.5份～8.3份。

18、雙重rt-pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，56℃~58℃退火30sec，72℃延伸?45sec?,?30個(gè)～35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

19、最終規(guī)定了雙重rt-pcr所適用的待測(cè)樣本，待測(cè)樣本包括并不限于黃瓜等瓜類作物種子，黃瓜等瓜類作物葉片和瓜條等植株所有部位，蚜蟲、粉虱和薊馬等傳毒介體和土壤及病殘?bào)w等獲取的待測(cè)樣本。

20、本發(fā)明進(jìn)一步公開了黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒的雙重rt-pcr檢測(cè)方法，用于快速、有效地檢測(cè)待測(cè)樣本是否攜帶黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：該檢測(cè)方法對(duì)黃瓜花葉病毒（cmv）、煙草花葉病毒（tmv）、黃瓜綠斑駁病毒（cgmmv）、甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒（mnsv）、瓜類褪綠黃化病毒（ccyv）等5種常見瓜類病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，有較好的特異性和靈敏度。

21、本發(fā)明公開的黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒檢測(cè)引物組及檢測(cè)方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的有益效果在于：

22、本發(fā)明所提供的黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒檢測(cè)引物基因組及檢測(cè)方法，與電鏡檢測(cè)病毒和酶聯(lián)免疫吸附法病毒等方法相比，具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)結(jié)果可靠、容易判斷、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，具體如下：

23、1、電鏡檢測(cè)病毒，此法具有最經(jīng)典、最有效、最可靠等優(yōu)點(diǎn)，但存在病毒粒子分離難、需要昂貴設(shè)備等不利于在普通實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)。

24、2、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)病毒，雖然該方法具有靈敏度較高、特異性較好等優(yōu)點(diǎn)，但當(dāng)提取的病毒濃度較低時(shí)，特異性等就比較差，應(yīng)用時(shí)存在一定的局限性。

25、3、本發(fā)明所提供的以黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒基因組建立的雙重rt-pcr檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間較短、靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果可靠、容易判斷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)?；蚴沁z傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，不易受外界因素等的影響，同時(shí)得到的檢測(cè)圖譜具有特異性條帶：333bp或669bp，其顯性標(biāo)記判斷一目了然。

26、本發(fā)明可檢測(cè)包括并不限于黃瓜等瓜類作物種子，黃瓜等瓜類作物葉片和瓜條等植株所有部位，蚜蟲、粉虱和薊馬等傳毒介體和土壤及病殘?bào)w等獲取的待測(cè)樣本，可通過檢測(cè)判定是否攜帶黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒。健康的種苗和栽培環(huán)境是生產(chǎn)的基礎(chǔ)，種苗等質(zhì)量的好壞關(guān)系到種植的成敗，本發(fā)明對(duì)黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒的檢測(cè)，可避免在生產(chǎn)上使用攜帶黃瓜葉斑病毒和黃瓜保加利亞潛隱病毒的種苗等，保證種植安全；該檢測(cè)技術(shù)有較大的應(yīng)用價(jià)值。