本公開涉及一種生產(chǎn)復(fù)雜寡糖(例如至少六個單糖的復(fù)雜巖藻糖基化和/或唾液酸化hmo或中性hmo)的方法?；旌戏椒▽l(fā)酵和發(fā)酵培養(yǎng)基中的酶促反應(yīng)組合，從而允許在持續(xù)發(fā)酵的培養(yǎng)基中形成復(fù)雜寡糖。本文還描述了從混合工藝衍生的hmo混合物以及此類混合物的用途。

背景技術(shù)：

1、已經(jīng)通過化學(xué)合成途徑、酶促途徑和體內(nèi)發(fā)酵方法致力于更復(fù)雜的人乳寡糖(hmo)的生產(chǎn)。對于工業(yè)用途而言，化學(xué)途徑過于復(fù)雜且昂貴。

2、hmo的酶促合成依賴于供體寡糖(hmo)和受體寡糖(hmo)的使用，它們由具有轉(zhuǎn)糖苷酶活性的酶催化以產(chǎn)生第三種寡糖(復(fù)雜hmo)，但是由于酶促反應(yīng)的性質(zhì)，通過這種途徑產(chǎn)生的hmo將始終是供體、受體和第三種寡糖(hmo)、以及由于酶促反應(yīng)的平衡而導(dǎo)致的供體底物部分釋放的副產(chǎn)物(離去基團(tuán)，例如乳糖)的混合物(參見例如wo2012/156897、wo2012/156898和wo2016/063262)。此外，酶促工藝使用單獨(dú)生產(chǎn)和純化的供體和受體底物，這增加了工藝成本。此外，在供體底物釋放的副產(chǎn)物是乳糖的情況下，需要進(jìn)行大量純化以去除這種大量的不需要的乳糖。

3、使用體內(nèi)發(fā)酵的hmo生物生產(chǎn)系統(tǒng)是目前生產(chǎn)較小的巖藻糖基化和唾液酸化和中性核心hmo的優(yōu)選方式(有關(guān)綜述參見bych等人2019年，current?opinion?inbiotechnology?56:130-137)。但是，對于更復(fù)雜的hmo，發(fā)酵途徑可能面臨將hmo從細(xì)胞輸出至培養(yǎng)基的挑戰(zhàn)，這對于實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的高產(chǎn)量是必要的。

4、由于乳糖在許多生物生產(chǎn)工藝中用作初始底物，因此在發(fā)酵結(jié)束時通常有過量的乳糖，這可能干擾期望寡糖產(chǎn)物的后續(xù)純化。wo2015/036138描述在培養(yǎng)基中使用合適的糖苷酶(例如β-半乳糖苷酶)來降解過量的乳糖。

5、發(fā)明目的

6、本公開已經(jīng)鑒定一種混合工藝，適用于生產(chǎn)一種或多種寡糖，例如hmo。該工藝特別適用于生產(chǎn)復(fù)雜巖藻糖基化和/或唾液酸化hmo。該混合工藝是發(fā)酵和發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物(第一種寡糖)與第二種寡糖或二糖的酶促反應(yīng)的組合，使得在發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生期望的更復(fù)雜的第三種寡糖。該工藝的一些益處在于，不需要或僅需要起始寡糖(第二種寡糖)中至少一種是純的形式，從而降低了該工藝的成本，并且酶促步驟期間產(chǎn)生的副產(chǎn)物(例如乳糖)作為生產(chǎn)第一種寡糖和可能生產(chǎn)的第二種寡糖的原料，被遺傳修飾微生物菌株原位循環(huán)利用，從而在該工藝結(jié)束時降低了酶促工藝的最終副產(chǎn)物(例如乳糖)水平。在該工藝僅包括一種遺傳修飾細(xì)胞的實(shí)施方式中，在第一種寡糖的整個發(fā)酵過程中，乳糖的進(jìn)料可以顯著減少或完全省略。乳糖的循環(huán)利用還將酶促工藝的平衡移向期望的第三種寡糖(繞過平衡屏障)，以使第一種或第二種底物(供體或受體)寡糖幾乎完全轉(zhuǎn)化。因此，相對于第一種和/或第二種寡糖，可以產(chǎn)生比常規(guī)酶促工藝更高比率的期望的第三種寡糖。此外，由于期望寡糖的生成發(fā)生在發(fā)酵培養(yǎng)基中，而不是在遺傳修飾微生物菌株內(nèi)部，因此解決了將復(fù)雜/大寡糖輸出細(xì)胞外的挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)涉及一種生產(chǎn)寡糖的混合方法，其中該方法將產(chǎn)生供體底物(寡糖)和/或受體底物(寡糖或二糖)的發(fā)酵工藝與酶促轉(zhuǎn)糖苷酶反應(yīng)組合。發(fā)酵工藝產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)糖苷酶反應(yīng)的第一種底物，并將第二種底物供給至正在運(yùn)行的發(fā)酵，其中在轉(zhuǎn)糖苷酶的存在下，在培養(yǎng)基中形成第三種(產(chǎn)物)寡糖。該工藝進(jìn)一步產(chǎn)生副產(chǎn)物，該副產(chǎn)物在發(fā)酵過程中由細(xì)胞通過副產(chǎn)物輸入蛋白(例如，乳糖、乳-n-二糖或n-乙酰乳糖胺輸入蛋白)輸入，以產(chǎn)生更多的第一種底物。

2、一方面是一種從供體寡糖和受體寡糖或受體二糖生產(chǎn)寡糖的方法，所述方法包括以下步驟：

3、a)在供給有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生至少三個單糖單元的第一種寡糖的遺傳修飾細(xì)胞，其中遺傳修飾細(xì)胞包括編碼以下的一種或多種核酸：

4、i)至少一種副產(chǎn)物輸入蛋白，以及

5、ii)至少一種重組糖基轉(zhuǎn)移酶，以及

6、iii)至少一種產(chǎn)生核苷酸活化糖的通路，以及

7、b)向培養(yǎng)基供給第二種二糖或寡糖，以及

8、c)使得具有轉(zhuǎn)糖苷酶活性的酶在培養(yǎng)基中可用，以及

9、d)在產(chǎn)生第一種寡糖的培養(yǎng)基中孵育第一種寡糖、第二種二糖或寡糖和轉(zhuǎn)糖苷酶以形成第三種寡糖。

10、在實(shí)施方式中，第三種寡糖是至少四個單糖單元的復(fù)雜寡糖，其選自dfl、fsl、lewis?b、lewis?y、唾液酸-lewis?a、唾液酸-lewis?b、lnfp-i、lnfp-ii、lnfp-iii、lnfp-iv、lnfp-v、lnfp-vi、lst-a、lst-b、lst-c、dslnt、lndfh-i、lndfh-ii、lndfh-iii、flst-a、flst-b、flst-c、plnh、plnnh、lnh、lnnh、flnh-i、flnh-ii、flnh-iii、fplnh-i、fplnnh?ii、df-lnf-i、df-lnf-ii、df-lnf-iii、df-對-lnh、df-對lnnh、flnnha、flnnhb、dflnnh、tf-lnh、slnh、fslnh、slnnh-i、fslnnh-i、slnnh-ii和ds-flnh-ii。

11、在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，遺傳修飾細(xì)胞產(chǎn)生供體寡糖，其選自三至五個單糖單元的巖藻糖基化寡糖、三至五個單糖單元的唾液酸化寡糖和三至四個單糖單元的中性核心寡糖。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，供體寡糖選自2’fl、3fl、dfl、lnfp-i、fsl、3’sl、3’slacnac、3’slnb、6’sl、lst-a、lnt-ii、lnt和lnnt的hmo。

12、在其他實(shí)施方式中，遺傳修飾細(xì)胞產(chǎn)生選自2’fl、3fl、2’flacnac、2’flnb、lewisa、lewis?x、lnt-ii、lnt、lnnt、對-lnnh、lnfp-i、lnfp-ii、lnfp-iii、lnfp-iv、lnfp-v、lnfp-vi、3’sl、6’sl、lst-a和lst-c的受體寡糖，其優(yōu)選輸出至培養(yǎng)基中。

13、在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，第二種二糖或寡糖選自lacnac、lnb、2’fl、3fl、2’flacnac、2’flnb、lewis?a、lewis?x、3’sl、lnt、lnnt、lnfp-i、lnfp-ii、lnfp-iii、lnfp-v、lnfp-vi、lst-a、lst-c、lnh、f-lnh-ii、f-lnh-iii、df-lnh-i、df-lnh-ii、df-lnh-iii、s-lnh、ds-lnh、fs-lnh、lnnh、對-lnh和對-lnnh。在與第一種遺傳工程細(xì)胞在同一培養(yǎng)基中共培養(yǎng)的第二種遺傳工程細(xì)胞將第二種寡糖供給至培養(yǎng)基的實(shí)施方式中，由所述第二種遺傳工程細(xì)胞產(chǎn)生的寡糖優(yōu)選輸出至培養(yǎng)基中。

14、在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)糖苷酶選自α-1,2-轉(zhuǎn)巖藻糖苷酶、α-1,3-轉(zhuǎn)巖藻糖苷酶、α-1,3/4-轉(zhuǎn)巖藻糖苷酶、α-2,3-轉(zhuǎn)唾液酸酶、α-2,6-轉(zhuǎn)唾液酸酶、β-n-乙酰葡糖胺糖苷酶、反式-乳-n-二糖苷酶和反式-β-半乳糖苷酶。轉(zhuǎn)糖苷酶可以在發(fā)酵過程中添加至培養(yǎng)基中，或者可以由遺傳工程細(xì)胞表達(dá)。

15、本文描述的另一方面是通過實(shí)例中公開的混合方法生產(chǎn)的組合物。具體地，hmo組合物基本上由以下組成：

16、a)至少50wt％的fsl、20至45wt％的3fl、以及0.1至2wt％的3’sl和0至3wt％的乳糖，或者

17、b)至少50wt％的lst-a、15至40wt％的lnt、0至15wt％的3’sl和0至2wt％的乳糖，或者

18、c)至少50wt％的lst-c、15至25wt％的lnnt、15至25wt％的6’sl和0至7wt％的乳糖，以及

19、其中總組合物中各成分占100wt％，并且組合物為至少兩種成分的混合物。

20、另一方面是本文所述的hmo組合物在生產(chǎn)營養(yǎng)組合物中的用途。