本發(fā)明屬于酶工程和基因工程，具體涉及檀香烯合酶突變體、工程菌及其在制備檀香揮發(fā)油中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、檀香揮發(fā)油提取自檀香科檀香屬植物的心材，其中印度檀香揮發(fā)油品質(zhì)最高，其主要成分為α-檀香醇和β-檀香醇等倍半萜類化合物。檀香揮發(fā)油具有特殊的香味，因此被廣泛應(yīng)用于香水和食品添加劑等日?；ぎa(chǎn)品和食品上，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，檀香揮發(fā)油還具有抗高血糖、抗癌、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等生物活性，目前印度檀香揮發(fā)油已開展多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，主要集中在皮膚病和口腔疾病領(lǐng)域，例如皮膚疣和斑塊性銀屑病。

2、檀香樹生長條件極為苛刻，通常25年樹齡以上成熟檀香的心材才可提取出高品質(zhì)檀香揮發(fā)油。由于過度的采伐和棲息地環(huán)境的變化，近年檀香數(shù)量迅速減少，印度檀香已被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟易危物種紅色名錄》。目前市場上符合國際標(biāo)準(zhǔn)(iso?3518:2002)的印度檀香資源枯竭，檀香揮發(fā)油供不應(yīng)求，價(jià)格持續(xù)上漲，如tfs公司生產(chǎn)的制藥級(jí)檀香揮發(fā)油，售價(jià)約為每公斤4500美元。

3、近年來，合成生物學(xué)在規(guī)?；a(chǎn)生物燃料、精細(xì)化學(xué)品、天然藥物分子等領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展。在檀香揮發(fā)油主要成分的生物合成途徑中，細(xì)胞色素p450酶cyp736a167對檀香烯合酶sassy的四種環(huán)化產(chǎn)物的選擇性無差別，因此檀香醇等四種氧化分子之間的比例與四種環(huán)化產(chǎn)物的比例高度一致，所以檀香揮發(fā)油中成分的比例主要由檀香烯合酶決定(圖1)。由于野生型檀香烯合酶sassy會(huì)合成大量的香檸檬烯，限制了其在構(gòu)建高品質(zhì)檀香揮發(fā)油酵母工程菌株中的應(yīng)用，因此，通過酶工程改造檀香烯合酶sassy可以優(yōu)化檀香揮發(fā)油的成分比例，實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)檀香揮發(fā)油的微生物法生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的首要目的在于提供檀香烯合酶突變體。

2、本技術(shù)的另一目的在于提供產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌。

3、本技術(shù)的再一目的在于提供上述產(chǎn)檀香揮發(fā)油釀酒酵母工程菌的應(yīng)用。

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

5、檀香烯合酶突變體，所述的檀香烯合酶突變體由seq?id?no.1所示氨基酸序列的野生型檀香烯合酶sassy發(fā)生部分位點(diǎn)突變而形成的，所述的部分位點(diǎn)包含seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸和282位苯丙氨酸中的至少一種。

6、進(jìn)一步的，所述檀香烯合酶突變體的氨基酸序列優(yōu)選為下列突變序列中的任一種：

7、sassys329m突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)榧琢虬彼岬玫剑?/p>

8、sassys329f突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼岬玫?/p>

9、sassys329w突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)樯彼岬玫剑?/p>

10、sassys329a突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)楸彼岬玫剑?/p>

11、sassys329c突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬玫剑?/p>

12、sassys329d突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)樘於彼岬玫剑?/p>

13、sassys329e突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)楣劝彼岬玫剑?/p>

14、sassys329g突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)楦拾彼岬玫剑?/p>

15、sassys329h突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)榻M氨酸得到；

16、sassys329i突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼岬玫剑?/p>

17、sassys329k突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬玫剑?/p>

18、sassys329l突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)榱涟彼岬玫剑?/p>

19、sassys329n突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)樘於０返玫剑?/p>

20、sassys329q突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)楣劝滨０返玫剑?/p>

21、sassys329r突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)榫彼岬玫剑?/p>

22、sassys329t突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸得到；

23、sassys329v突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)槔i氨酸得到；

24、sassys329y突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的329位絲氨酸突變?yōu)槔野彼岬玫剑?/p>

25、sassyf282w突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的282位苯丙氨酸突變?yōu)樯彼岬玫剑?/p>

26、sassyf282w-s329f突變體，其氨基酸序列通過將seq?id?no.1所示的氨基酸序列的282位苯丙氨酸突變?yōu)樯彼幔约?29位絲氨酸突變?yōu)楸奖彼岬玫健?/p>

27、作為本發(fā)明所述檀香烯合酶突變體的一種優(yōu)選方案，其中：所述檀香烯合酶突變體，還包括:

28、sassys329m突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閍tg；

29、sassys329f突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閠tt；

30、sassys329w突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閠gg；

31、sassys329a突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)間ct；

32、sassys329c突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閠gc；

33、sassys329d突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)間at；

34、sassys329e突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)間aa；

35、sassys329g突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)間gt；

36、sassys329h突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閏ac；

37、sassys329i突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閍tt；

38、sassys329k突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閍ag；

39、sassys329l突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閠tg；

40、sassys329n突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閍ac；

41、sassys329q突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閏aa；

42、sassys329r突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閍ga；

43、sassys329t突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閍ct；

44、sassys329v突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)間tt；

45、sassys329y突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第329位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的tcc突變?yōu)閠ac；

46、sassyf282w突變體，其核苷酸序列通過將seq?id?no.1的第282位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的ttt突變?yōu)閠gg；

47、sassyf282w-s329f突變體，其核苷酸序列優(yōu)選通過將seq?id?no.1的第282位氨基酸密碼子由seq?id?no.2中的ttt突變?yōu)閠gg，以及將第329位氨基酸密碼子tcc突變?yōu)閠tt；

48、作為本發(fā)明所述檀香烯合酶突變體的一種優(yōu)選方案，其中：所述野生型檀香烯合酶sassy來源于植物檀香(santalum?album?l.)，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

49、根據(jù)檀香烯合成酶sassy的氨基酸序列，由金斯瑞生物科技有限公司以釀酒酵母為宿主經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

50、產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌包含應(yīng)用上述任意檀香烯合酶突變體構(gòu)建的產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌。

51、產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌，具有如下特點(diǎn)：以釀酒酵母saccharomycescerevisiae為出發(fā)菌株，過表達(dá)檀香烯合酶突變體基因msassy、細(xì)胞色素p450酶基因cyp736a167和細(xì)胞色素p450還原酶基因sacpr2。

52、其中msassy、cyp736a167和sacpr2整合到釀酒酵母met17基因位點(diǎn)。

53、具體地，作為一種優(yōu)選方式，所述的產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

54、(1)基因表達(dá)模塊的構(gòu)建

55、(a)將同源臂met17up、篩選標(biāo)記ura3和同源臂met17down順序連接，得到met17up-ura3-met17down模塊，命名為模塊1；

56、(b)將啟動(dòng)子pfba1、cyp736a167和終止子tpgi1順序連接，得到pfba1-cyp736a167-tpgi1模塊，命名為模塊2；

57、(c)將啟動(dòng)子ptpi1、sacpr2和終止子tadh1順序連接，得到ptpi1-sacpr2-tadh1模塊，命名為模塊3；

58、(d)啟動(dòng)子ppgk1、msassy和終止子tadh1順序連接，得到ppgk1-msassy-tadh1模塊，命名為模塊4。

59、(2)整合載體的構(gòu)建

60、將上述模塊1～4構(gòu)建到pcfb2988載體上，得到整合載體pcfb2988-1。

61、(3)菌株的構(gòu)建

62、(a)以上述整合載體pcfb2988-1為模板，克隆met17up-ppgk1-msassy-tadh1-pfba1-cyp736a167-tpgi1-ptpi1-sacpr2-tadh1-ura3-met17down整合模塊；

63、(b)將上述整合模塊轉(zhuǎn)化釀酒酵母，然后通過酵母缺陷型培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，得到菌株sanm，即所述產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌。

64、所述的msassy基因的序列為檀香烯合酶sassy突變體的核苷酸序列中的至少一種；優(yōu)選為sassys329m突變體的核苷酸序列。

65、步驟(1)中，所述的cyp736a167、sacpr2和ura3為本實(shí)驗(yàn)室保存，其中，cyp736a167的核苷酸序列見genbank:ku169302.1；sacpr2的核苷酸序列見genbank:kc842188.1；ura3的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

66、步驟(1)中，所述的ppgk1、pfba1、ptpi1、tpgi1、tadh1、met17up和met17down可從釀酒酵母基因組克隆得到，其中，ppgk1的核苷酸序列見genbank:cp020125.1，從第142054位到第143036位；pfba1的核苷酸序列見genbank:cp020133.1，從第327996位到第327497位；ptpi1的核苷酸序列見genbank:cp020126.1，從第564689位到第564189位；tpgi1的核苷酸序列見genbank:cp020124.1，從第612625位到第612226位；tadh1的核苷酸序列見genbank:cp020137.1，從第159575位到第159411位；met17up的核苷酸序列見genbank:cp020134.1，從第726291位到第726591位；met17down的核苷酸序列見genbank:cp020134.1，從第727927位到第728222位。

67、上述產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌在制備檀香揮發(fā)油中的應(yīng)用。

68、一種制備檀香揮發(fā)油的方法，通過將上述產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌接種于含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵液用正己烷萃取，即得發(fā)酵產(chǎn)物檀香揮發(fā)油。

69、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)具有以下有益效果：

70、本發(fā)明提供了上述檀香烯合酶突變體，相較于野生型檀香烯合酶sassy，其產(chǎn)物中α-檀香烯和β-檀香烯的含量比例顯著增加。以突變體sassys329m為例構(gòu)建產(chǎn)檀香揮發(fā)油的釀酒酵母工程菌sanm，將得到的釀酒酵母工程菌株sanm進(jìn)行6天發(fā)酵培養(yǎng)，可合成檀香揮發(fā)油的主要成分α-檀香醇和β-檀香醇，其中α-檀香醇和β-檀香醇的成分比例分別為43.6％和25.2％。本發(fā)明利用sassys329m等本發(fā)明提供的檀香烯合酶突變體構(gòu)建的釀酒酵母工程菌株能夠制備符合國際標(biāo)準(zhǔn)的高品質(zhì)檀香揮發(fā)油。