本發(fā)明屬于作物分子生物學(xué)和分子育種領(lǐng)域，具體涉及小麥雜交壞死基因ne1克隆與功能標(biāo)記開發(fā)。

背景技術(shù)：

1、小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，全球約三分之一的人口以小麥為主糧。雜交育種是目前培育小麥新品種最普遍且成效最大的一種育種方法。而在小麥雜交育種過程中，雜交后代經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)雜種壞死的現(xiàn)象，這就極大限制了親本優(yōu)良性狀的自由聚合(caldwell?et?al,1943；hermsen?1963a)，嚴(yán)重阻礙了小麥的遺傳改良和新品種選育。

2、小麥的雜交壞死是由一對(duì)互補(bǔ)基因ne1和ne2共同控制(chu?et?al,2006)，當(dāng)它們通過雜交被聚合到一起時(shí)會(huì)引起雜種壞死。雖然小麥雜種壞死現(xiàn)象已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100年的歷史(sax?1921)，但其分子機(jī)理卻仍然不是很清楚，使其成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。最近，國內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道克隆了其中一個(gè)雜交壞死基因ne2,其編碼一個(gè)cc-nbs-lrr類型的抗病蛋白，并證明其與小麥高溫抗葉銹基因lr13為同一個(gè)基因(yan?et?al,2021；hewittet?al,2021；si?et?al,2021b)。

3、nishikawa等(1974)利用普通小麥端體材料將ne1基因定位在5bl距離著絲粒9.4±1.5cm(nishikawa?et?al,1974)。chu(2006)等人利用ssr分子標(biāo)記構(gòu)建了ne1和ne2的遺傳連鎖圖譜，其中ne1和ne2與各自最近的ssr標(biāo)記xbarc74和xbarc55的遺傳距離分別為2.0cm和3.2cm(chu?et?al,2006)。最近，ne1基因的精細(xì)定位工作也取得進(jìn)展。li等(2021)將ne1基因定位于分子標(biāo)記xwgrc3074和xwgrc3009之間0.19cm的遺傳距離，對(duì)應(yīng)中國春的物理距離為4.45mb(li?et?al,2021)。si等(2021)將ne1基因定位于分子標(biāo)記5b-383和sn-2142之間，對(duì)應(yīng)中國春的物理距離為4.06mb(si?et?al,2021)。zhang等(2022)報(bào)道將ne1基因精細(xì)定位到分子標(biāo)記nwu_5b_4137和nwu_5b_5114之間0.5cm(zhang?et?al,2022)。

4、然而目前ne1基因始終沒有被克隆。克隆ne1基因及利用ne1-ne2互作的獨(dú)特遺傳系統(tǒng)解析雜種壞死形成的分子機(jī)理將會(huì)完全揭開小麥雜種壞死的神秘面紗，同時(shí)可以為在小麥雜交育種過程中克服雜交壞死的遺傳障礙提供理論指導(dǎo)，也可以為利用ne2編碼nlr抗病蛋白進(jìn)行抗病性精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)奠定理論基礎(chǔ)，對(duì)培育高產(chǎn)抗病小麥優(yōu)良新品種，具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供小麥雜交壞死基因ne1克隆與功能標(biāo)記開發(fā)。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，命名為ne1蛋白，其為如下a1)-a4)中任一所示的蛋白質(zhì)：

3、a1)由seq?id?no.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

4、a2)在seq?id?no.3所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白；

5、a3)將seq?id?no.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

6、a4)與a1)-a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

7、第二方面，本發(fā)明提供了編碼第一方面所述蛋白質(zhì)的核酸分子。

8、上文所述核酸分子命名為基因ne1，位于小麥5bl染色體上，為如下任一種：

9、b1)seq?id?no.2所示的dna分子，其為cdna序列；

10、b2)seq?id?no.1或seq?id?no.1第2407-10,563位(基因組序列)所示的dna分子；

11、b3)與b1)或b2)限定的dna序列具有98％以上同源性且編碼相同功能蛋白的dna分子；

12、b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的dna序列雜交且編碼相同功能蛋白的dna分子；

13、b5)與b1)或b2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白的的dna分子。

14、第三方面，本發(fā)明提供了含有第二方面所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體或重組微生物。

15、第四方面，本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白質(zhì)或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表達(dá)盒、重組載體或重組微生物在如下任一中的應(yīng)用：

16、c1)培育具有壞死表型的植物，所述植物中含有ne2基因；

17、c2)在使含有ne2基因的植物具有壞死表型；

18、c3)與ne2基因共同作用使植物壞死。

19、第五方面，本發(fā)明提供了一種具有壞死表型的轉(zhuǎn)基因植物的制備，包括如下步驟：將第二方面所述核酸分子導(dǎo)入含有ne2基因的目的植物中，得到具有壞死表型的轉(zhuǎn)基因植物。

20、第六方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增第二方面所述核酸分子全長或部分的引物對(duì)，其由seq?id?no.4所示的單鏈dna分子和seq?id?no.5所示的單鏈dna分子組成。

21、第七方面，本發(fā)明提供了含有第六方面所述引物對(duì)的pcr試劑或試劑盒。

22、第八方面，本發(fā)明提供了第七方面所述的引物對(duì)或所述的pcr試劑或試劑盒在鑒定植物品種中是否含有第二方面所述核酸分子中的應(yīng)用。

23、上文中，所述植物品種可以為含有ne1和ne2基因的植物雜交后代，進(jìn)一步地，具體為壞死系m114的雜交后代。在本發(fā)明的實(shí)施例中，是雜交后代壞死系m114和普通小麥品種周麥22的雜交后代。

24、上文所述植物包括但不僅限于小麥。

25、本發(fā)明采用的ems誘變創(chuàng)制壞死系m114復(fù)綠突變體，其表型如(圖4)所示。

26、本發(fā)明提供了ne1基因的自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因載體，其通過參考文獻(xiàn)報(bào)道(luet?al.a?rare?gain?of?function?mutation?in?a?wheat?tandem?kinase?confersresistance?to?powdery?mildew.nat.commun.2020；11,680)方法構(gòu)建得到。

27、本發(fā)明提供了小麥雜交壞死基因ne1的基因定位、圖位克隆、突變體和轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證以及功能標(biāo)記開發(fā)。小麥雜交壞死基因ne1的克隆將完全揭開小麥雜種壞死形成的神秘面紗，可為在小麥雜交育種過程中克服雜交壞死的遺傳障礙提供理論指導(dǎo)，促進(jìn)高效聚合優(yōu)良性狀培育小麥新品種，具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種蛋白質(zhì)，其為如下a1)-a4)中任一所示的蛋白質(zhì)：

2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于：

4.含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體或重組微生物。

5.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2或3所述核酸分子或權(quán)利要求4所述表達(dá)盒、重組載體或重組微生物在如下任一中的應(yīng)用：

6.一種具有壞死表型的轉(zhuǎn)基因植物的制備，包括如下步驟：將權(quán)利要求2或3所述核酸分子導(dǎo)入含有ne2基因的目的植物中，得到具有壞死表型的轉(zhuǎn)基因植物。

7.用于擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述核酸分子全長或部分的引物對(duì)，其由seq?id?no.4所示的單鏈dna分子和seq?id?no.5所示的單鏈dna分子組成。

8.含有權(quán)利要求7所述引物對(duì)的pcr試劑或試劑盒。

9.權(quán)利要求7所述的引物對(duì)或權(quán)利要求8所述的pcr試劑或試劑盒在鑒定小麥品種中是否含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了小麥雜交壞死基因Ne1克隆與功能標(biāo)記開發(fā)。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，由SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。還提供了編碼蛋白的核酸分子，命名為Ne1基因，其為SEQ?ID?No.2所示的DNA分子，或，SEQ?ID?No.1或SEQ?IDNo.1第2407?10,563位所示的DNA分子；本發(fā)明提供了小麥雜交壞死基因Ne1的基因定位、圖位克隆、突變體和轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證以及功能標(biāo)記開發(fā)。小麥雜交壞死基因Ne1的克隆將完全揭開小麥雜種壞死形成的神秘面紗，可為在小麥雜交育種過程中克服雜交壞死的遺傳障礙提供理論指導(dǎo)，促進(jìn)高效聚合優(yōu)良性狀培育小麥新品種，具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：劉志勇,李淼淼,張懷志,陳永興,朱科宇,董磊,崔雪佳,董玲麗
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/19