本發(fā)明屬于作物分子生物學(xué)和分子育種領(lǐng)域，具體涉及小麥廣譜抗白粉病基因pm26克隆及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麥專化型(blumeria?graminisf.sp.tritici)引起的真菌性病害。小麥白粉病是世界性小麥重要病害，對(duì)小麥的生產(chǎn)安全提出了重要挑戰(zhàn)。根據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心統(tǒng)計(jì)，近十年來我國小麥白粉病發(fā)生面積約為1億畝，約占當(dāng)年所有小麥病害的1/5。生產(chǎn)實(shí)踐表明，與噴灑化學(xué)藥劑相比，選育和推廣抗病品種是防治小麥白粉病最為經(jīng)濟(jì)安全有效的措施，而培育抗病品種的關(guān)鍵在于挖掘抗病基因。截至目前，已經(jīng)在普通小麥及其近緣種屬中正式命名69個(gè)抗白粉病基因。這些抗白粉病基因的挖掘和利用，拓寬了小麥抗病育種的遺傳資源，為防治小麥白粉病發(fā)揮了重要作用。然而，新的毒性白粉菌生理小種不斷變異，導(dǎo)致一些基因抗性降低或喪失。如pm8曾是我國最廣泛應(yīng)用的抗白粉病基因，其抗性喪失引起20世紀(jì)末白粉病大爆發(fā)。目前我國小麥推廣品種中仍有效或在部分地區(qū)有效的抗白粉病基因主要是pm2，pm4和pm21等少數(shù)幾個(gè)基因及其等位變異。因此克隆和利用一些抗性較好、來源多樣的抗白粉病基因?qū)μ岣呶覈←溈共∮N具有重要意義。

2、野生二粒小麥(triticum?dicoccoides,aabb)是小麥的野生親緣種，是四倍體和六倍體小麥的直接祖先。野生二粒小麥生長(zhǎng)遍布在多個(gè)生態(tài)環(huán)境中，經(jīng)歷長(zhǎng)期復(fù)雜的環(huán)境演變，積累豐富的遺傳多樣性，且蘊(yùn)含著豐富的抗白粉病基因。截止目前，已經(jīng)從野生二粒小麥中發(fā)掘定位出8個(gè)正式命名的抗白粉病基因，如pm16、pm26、pm30、pm36、pm41、pm42、pm64和pm69，除了pm41和pm69外，其他基因沒有克隆出來。發(fā)掘和克隆野生二粒小麥中的抗白粉病基因，對(duì)于通過現(xiàn)代遺傳操作如分子標(biāo)記輔助選擇和基因編輯等技術(shù)利用抗白粉病基因進(jìn)行現(xiàn)代小麥品種遺傳改良具有重要意義。

3、目前，已經(jīng)從小麥及其野生種中成功克隆多個(gè)小麥抗白粉病基因，如pm1，pm2，pm3，pm4,pm5，pm8，pm13，pm17，pm21，pm24，pm36，pm38/lr34/yr18/sr57，pm41，pm46/lr67/yr46/sr55，pm57，pm60，pm69和wtk4。其中61％的抗白粉病基因均編碼典型的nlr(nucleotide-binding?leucine-rich?repeat)類型抗病蛋白。nlr類型的抗病蛋白可以特異性識(shí)別病原菌效應(yīng)因子，使植物在病原菌侵染位點(diǎn)形成局部的程序性細(xì)胞死亡現(xiàn)象，即超敏反應(yīng)(hypersensitive?response,hr)，限制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而保護(hù)植物其他部位免受病原菌的侵染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供小麥廣譜抗白粉病基因pm26克隆及其應(yīng)用。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種蛋白，命名為pm26蛋白，為如下(1)或(2)：

3、1)由seq?id?no.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

4、2)將seq?id?no.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/

5、或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

6、第二方面，本發(fā)明提供了編碼第一方面所述蛋白的核酸分子。

7、上文所述核酸分子，命名為基因pm26，其位于小麥2bs染色體上，是如下1)-4)中任一種的dna分子：

8、1)編碼區(qū)為seq?id?no.1第3001-9489位所示的dna分子，為基因組dna；

9、2)編碼區(qū)為seq?id?no.2所示的dna分子，為cdna；

10、3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子；

11、4)與1)或2)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

12、第三方面，本發(fā)明提供了含有第二方面所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒或重組菌。

13、第四方面，本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白、第二方面所述核酸分子或第三方面所述的重組載體、表達(dá)盒或重組菌在調(diào)控植物抗白粉病中的應(yīng)用；上文中，調(diào)控為提高。

14、或，本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白、第二方面所述核酸分子或第三方面所述的重組載體、表達(dá)盒或重組菌在培育抗白粉病植物中的應(yīng)用。

15、第五方面，本發(fā)明提供了抑制第一方面所述蛋白的生物學(xué)功能(活性)的物質(zhì)或者抑制第二方面所述核酸分子表達(dá)的物質(zhì)在降低植物抗白粉病中的應(yīng)用；

16、或，抑制第一方面所述蛋白生物學(xué)功能的物質(zhì)或者抑制第二方面所述核酸分子表達(dá)的物質(zhì)在培育白粉病敏感植物中的應(yīng)用。

17、上文中，抑制第一方面所述蛋白的生物學(xué)功能(活性)的物質(zhì)或者抑制第二方面所述核酸分子表達(dá)的物質(zhì)具體為bsmv-vigs體系，包括pcabs-α，pcabs-β，pcabs-γblic-pm26。其中，pcabs-γblic-pm26為將seq?id?no.4所示的目的片段與pcabs-γblic載體二者進(jìn)行連接，構(gòu)建成沉默載體pcabs-γblic-pm26。

18、第六方面，本發(fā)明提供了一種培育抗白粉病的轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下1)

19、或2)：

20、1)所述的方法包括如下步驟：提高出發(fā)植物中第一方面所述蛋白的含量、生物學(xué)功能和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；

21、所述轉(zhuǎn)基因植物的白粉病抗性高于所述出發(fā)植物；

22、2)所述的方法包括如下步驟：提高出發(fā)植物中編碼第一方面所述蛋白的核酸分子的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；

23、所述轉(zhuǎn)基因植物的白粉病抗性高于所述出發(fā)植物。

24、第七方面，本發(fā)明提供了一種培育感白粉病的轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下1)或2)：

25、1)所述的方法包括如下步驟：降低出發(fā)植物中第一方面所述蛋白的含量、生物學(xué)功能和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；

26、所述轉(zhuǎn)基因植物的白粉病抗性低于所述出發(fā)植物；

27、2)所述的方法包括如下步驟：抑制出發(fā)植物中編碼第一方面所述蛋白的核酸分子的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；

28、所述轉(zhuǎn)基因植物的白粉病抗性低于所述出發(fā)植物。

29、所述植物包括但不僅限于小麥。

30、第八方面，本發(fā)明提供了擴(kuò)增第二方面所述核酸分子全長(zhǎng)或片段的引物對(duì)。

31、在本發(fā)明的實(shí)施例中，引物對(duì)為666com-1f/1r和666com-2f/2r，或，666oe-1f/1r。

32、本發(fā)明提供了pm26基因的bsmv-vigs載體，其通過參考文獻(xiàn)報(bào)道(yuan?c,li?c,yan?l,et?al.a?high?throughput?barley?stripe?mosaic?virus?vector?for?virusinduced?gene?silencing?in?monocots?and?dicots.plos?one.2011；6(10):e26468)方法構(gòu)建得到。其中用于構(gòu)建bsmv-vigs載體的pm26基因片段核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

33、本發(fā)明提供了pm26基因的互補(bǔ)表達(dá)載體和過表達(dá)載體，其通過參考文獻(xiàn)報(bào)道(luet?al.a?rare?gain?of?function?mutation?in?a?wheat?tandem?kinase?confersresistance?to?powdery?mildew.nat.commun.2020；11,680)方法構(gòu)建得到。

34、本發(fā)明提供了小麥廣譜抗白粉病基因pm26的基因定位、圖位克隆以及抗白粉病生物學(xué)功能鑒定方法。小麥廣譜抗白粉病基因pm26可以廣泛應(yīng)用于小麥抗病遺傳育種、種質(zhì)資源改良、轉(zhuǎn)基因和基因組編輯育種等植物領(lǐng)域，對(duì)改進(jìn)和改良小麥等作物的種質(zhì)資源具有重要作用。