本申請(qǐng)涉及基因工程，具體而言，涉及一種構(gòu)建生育障礙動(dòng)物模型的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、輔助生殖技術(shù)是人類輔助生殖技術(shù)(assisted?reproductive?technology，art)的簡(jiǎn)稱，指采用醫(yī)療輔助手段使不育夫婦妊娠的技術(shù)，包括人工授精(artificialinsemination，ai)和體外受精-胚胎移植(in?vitro?fertilization?and?embryotransfer，ivf-et)及其衍生技術(shù)兩大類。體外受精-胚胎移植及其衍生技術(shù)主要包括體外受精-胚胎移植(ivf-et)、配子或合子輸卵管內(nèi)移植(gift或zift)、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(icsi)、胚胎凍融(cet/fet)、植入前胚胎遺傳學(xué)診斷(pgd)等。

2、目前ivf/icsi技術(shù)只有30-40％的成功率且存在相當(dāng)一部分反復(fù)失敗病例。了解卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟、受精及早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵事件，研究卵母細(xì)胞向胚胎轉(zhuǎn)變機(jī)制，是提高輔助生殖技術(shù)成功率的關(guān)鍵。母源效應(yīng)基因(meg)是指在卵子發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物(mrna或蛋白質(zhì))儲(chǔ)存在卵母細(xì)胞中，并編碼指導(dǎo)胚胎發(fā)育的信號(hào)分子(轉(zhuǎn)錄因子、受體或翻譯調(diào)節(jié)蛋白)的一類基因。研究表明，哺乳動(dòng)物中megs的破壞會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)生缺陷。

3、近年來(lái)基于全外顯子測(cè)序技術(shù)成本的下降及分析水平的日漸成熟，結(jié)合輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，包括tle6在內(nèi)的33個(gè)megs突變與雌性不孕癥的關(guān)系相繼被闡明，然而對(duì)于上述基因的功能及其特定位點(diǎn)發(fā)揮的作用現(xiàn)在了解還不充分。

4、因此，如何更好了解特定基因的功能及其特定位點(diǎn)發(fā)揮的作用是研究雌性不孕癥的難點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問(wèn)題，更好研究特定基因位點(diǎn)對(duì)于胚胎發(fā)育的影響，本申請(qǐng)的第一目的在于提供一種構(gòu)建生育障礙動(dòng)物模型的方法，動(dòng)物為雌性，方法包括：使動(dòng)物的dlgap5蛋白在第359位氨基酸終止表達(dá)，以得到生育障礙動(dòng)物模型。

2、本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)，雌性動(dòng)物體內(nèi)dlgap5基因的功能和雌性生育能力的相關(guān)性，即雌性動(dòng)物體內(nèi)dlgap5蛋白提前終止表達(dá)會(huì)影響雌性動(dòng)物的生育能力，具體地，dlgap5蛋白的第359位氨基酸終止表達(dá)后即可導(dǎo)致雌性動(dòng)物不孕。

3、在其中一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)使dlgap5基因產(chǎn)生突變使動(dòng)物的dlgap5蛋白在第359位氨基酸終止表達(dá)，dlgap5基因的突變滿足以下條件(1)～(3)：

4、(1)dlgap5基因的第1075～1077位核苷酸產(chǎn)生無(wú)義突變；

5、(2)dlgap5基因的第1099～1101位核苷酸產(chǎn)生同義突變；

6、(3)dlgap5基因的突變通過(guò)crispr/cas9基因敲入產(chǎn)生；

7、可選地，dlgap5基因的第1075～1077位核苷酸由aat突變?yōu)閠ag；

8、可選地，dlgap5基因的第1099～1101位核苷酸由ttg突變?yōu)閏tc。

9、在其中一個(gè)實(shí)施例中，dlgap5基因的突變通過(guò)crispr/cas基因敲入產(chǎn)生包括：

10、采用dlgap5基因特異性靶點(diǎn)sgrna、cas蛋白和供體dna注入動(dòng)物受精卵，培育動(dòng)物受精卵，得到dlgap5基因敲入的動(dòng)物；

11、其中，供體dna含有dlgap5基因片段，dlgap5基因片段含有dlgap5基因的突變序列。

12、在其中一個(gè)實(shí)施例中，方法滿足以下條件(1)～(3)：

13、(1)sgrna包括如seq?id?no.1所示的序列；

14、seq?id?no.1：agacaaagcaaatgaaatcttgg；

15、(2)cas蛋白為cas9蛋白；

16、(3)供體dna包括如seq?id?no.2所示的序列；

17、seq?id?no.2：

18、tgtgaaatttgtttgtttgtttgtttgtttttcctgttagttttagcact?acaactcaagacaaagcataggaaatcttggtacagcaaggactcgagtc?gctaacagaccgtagtaaaggtacgttagtttaattaagctgtcacttct。

19、在其中一個(gè)實(shí)施例中，培育動(dòng)物受精卵，得到dlgap5基因敲入的動(dòng)物包括：

20、培育動(dòng)物受精卵得到f0代動(dòng)物；

21、將f0代動(dòng)物與野生型動(dòng)物交配獲得f1代雜合子動(dòng)物；

22、將f1代雜合子動(dòng)物雜交獲得f2代動(dòng)物，得到dlgap5基因敲入的動(dòng)物。

23、在其中一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)f0代動(dòng)物或者f2代動(dòng)物進(jìn)行篩選以獲得dlgap5基因敲入的純合子動(dòng)物；

24、可選地，篩選的步驟包括：

25、提取動(dòng)物的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以確定動(dòng)物的dlgap5基因型是否為純合子。

26、在其中一個(gè)實(shí)施例中，篩選的步驟滿足以下條件(1)～(2)：

27、(1)pcr擴(kuò)增采用的引物包括如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的序列；

28、seq?id?no.3：tatgacagaagcaactctgtgtgt；

29、seq?id?no.4：acgtctcctctgttagggttgtta；

30、(2)測(cè)序?yàn)閟anger測(cè)序；

31、可選地，sanger測(cè)序的引物包括如seq?id?no.5所示的序列；

32、seq?id?no.5：tatgacagaagcaactctgtgtgt。

33、在其中一個(gè)實(shí)施例中，動(dòng)物包括小鼠、大鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、駱駝、驢、鹿和貂中的至少一種。

34、本申請(qǐng)的第二目的在于提供上述方法構(gòu)建的動(dòng)物模型在制備或篩選與dlgap5基因基因缺陷相關(guān)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。

35、在其中一個(gè)實(shí)施例中，與dlgap5基因缺陷相關(guān)疾病包括雌性生育障礙。

技術(shù)特征：

1.一種構(gòu)建生育障礙動(dòng)物模型的方法，其特征在于，所述動(dòng)物為雌性，所述方法包括：使動(dòng)物的dlgap5蛋白在第359位氨基酸終止表達(dá)，以得到生育障礙動(dòng)物模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)使dlgap5基因產(chǎn)生突變使動(dòng)物的dlgap5蛋白在第359位氨基酸終止表達(dá)，所述dlgap5基因的突變滿足以下條件(1)～(3)：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述dlgap5基因的突變通過(guò)crispr/cas基因敲入產(chǎn)生包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法滿足以下條件(1)～(3)：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，培育所述動(dòng)物受精卵，得到dlgap5基因敲入的動(dòng)物包括：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，對(duì)所述f0代動(dòng)物或者所述f2代動(dòng)物進(jìn)行篩選以獲得dlgap5基因敲入的純合子動(dòng)物；

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述篩選的步驟滿足以下條件(1)～(2)：

8.根據(jù)權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述動(dòng)物包括小鼠、大鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、駱駝、驢、鹿和貂中的至少一種。

9.權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建的動(dòng)物模型在制備或篩選與dlgap5基因缺陷相關(guān)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述與dlgap5基因缺陷相關(guān)疾病包括雌性生育障礙。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)公開(kāi)了一種構(gòu)建生育障礙動(dòng)物模型的方法和應(yīng)用，動(dòng)物為雌性，方法包括：使動(dòng)物的DLGAP5蛋白在第359位氨基酸終止表達(dá)，以得到生育障礙動(dòng)物模型。本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)，雌性動(dòng)物體內(nèi)Dlgap5基因的功能和雌性生育能力具有相關(guān)性，且雌性動(dòng)物體內(nèi)DLGAP5蛋白在特定位點(diǎn)提前終止表達(dá)會(huì)影響雌性動(dòng)物的生育能力，具體地，DLGAP5蛋白的第359位氨基酸終止表達(dá)后即可導(dǎo)致雌性動(dòng)物不孕癥。

技術(shù)研發(fā)人員：鄭偉,胡慧玲,郭靜,林戈
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/19