本發(fā)明涉及生物，具體涉及重組腺病毒及其在制備禽呼腸孤病毒多價(jià)疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、禽呼腸孤病毒(avian?reovirus，arv)可感染各種禽類(lèi)，包括雞、鴨和鵝，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒的不斷變異使傳統(tǒng)的疫苗保護(hù)作用逐漸減弱，研究安全高效的新型arv疫苗成為解決此問(wèn)題的關(guān)鍵手段。

2、禽呼腸孤病毒是呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬中的一員，是一種雙鏈rna病毒，無(wú)囊膜，呈二十面體結(jié)構(gòu)，雙層衣殼。該病毒基因組為線性雙鏈rna，分10個(gè)節(jié)段，這些基因組片段編碼了10種結(jié)構(gòu)蛋白。其中由s1基因編碼的σc蛋白屬于外衣殼蛋白，參與細(xì)胞吸附，能夠誘導(dǎo)arv特異性中和抗體的產(chǎn)生，是研制arv診斷試劑和相關(guān)疫苗的重要候選蛋白基因。arv可感染多種禽類(lèi)，分布范圍非常廣泛。家禽感染后可導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降、飼料轉(zhuǎn)化率低、受感染家禽的均勻度低以及其他病毒或細(xì)菌的繼發(fā)感染，進(jìn)而給養(yǎng)殖企業(yè)帶來(lái)不可忽略的經(jīng)濟(jì)損失。arv通過(guò)水平傳播和垂直傳播病毒，傳播范圍廣泛。由于arv基因的重組等原因，變異率很高，需要研發(fā)新的疫苗。腺病毒載體疫苗具有免疫原性強(qiáng)、無(wú)需佐劑、宿主廣泛、操作簡(jiǎn)單、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是一種廣泛應(yīng)用的疫苗載體。

3、目前對(duì)arv的疫苗研究多以弱毒疫苗或者重組亞單位疫苗為主，尚無(wú)病毒載體疫苗的研究出現(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何制備禽呼腸孤病毒的病毒載體疫苗和/或如何制備基于黑猩猩腺病毒載體的禽呼腸孤病毒多價(jià)疫苗。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了重組腺病毒，所述重組腺病毒含有雞呼腸孤病毒ⅲ型σc蛋白的編碼基因、雞呼腸孤病毒ⅳ型σc蛋白的編碼基因和鴨新型呼腸孤病毒σc蛋白的編碼基因。

3、上述重組腺病毒可為將雞呼腸孤病毒ⅲ型σc蛋白的編碼基因、雞呼腸孤病毒ⅳ型σc蛋白的編碼基因和鴨新型呼腸孤病毒σc蛋白的編碼基插入到腺病毒載體中后導(dǎo)入包裝細(xì)胞得到的重組腺病毒。

4、所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體可為一個(gè)真核基因表達(dá)載體，其可含有真核基因表達(dá)載體所必需的元件，如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、polya加入的信號(hào)序列、復(fù)制起始序列(ori)等。

5、所述腺病毒載體可為adc68，adc6，adc7,adhu5,adc63或adhu26等。

6、所述腺病毒載體具體可為重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體質(zhì)粒adc68，所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體質(zhì)粒adc68可含有腺病毒載體adc68的除了e1基因、e3基因及e4基因的orf6/7和orf6序列的所有序列。所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體質(zhì)粒adc68還可含有人血清5型腺病毒的e4基因的orf6/7和orf6序列。

7、所述adc68可為黑猩猩腺病毒載體adc68xy3，所述adc68的genbank登錄號(hào)可為為：ac_000011.1。上述重組腺病毒中，所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體質(zhì)粒還可含有免疫佐劑的編碼基因序列。

8、所述免疫佐劑可為porb和/或cd40l。

9、所述porb是一種來(lái)自腦膜炎奈瑟菌的外膜蛋白，是一種基于tlr2配體的佐劑，作為疫苗佐劑，porb通過(guò)apc增加共刺激因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，增加抗體產(chǎn)生，改善抗原運(yùn)輸?shù)搅馨徒Y(jié)，并促進(jìn)廣泛的t細(xì)胞反應(yīng)。所述cd40l是cd40配體(cd40?ligand)，是一種糖蛋白，在活化t細(xì)胞等細(xì)胞表面表達(dá)。該分子屬于壞死因子超家族，已被定義為激活apcs的最重要的共刺激因子。

10、所述porb可為氨基酸序列是腦膜炎奈瑟菌的外膜蛋白的蛋白質(zhì)，所述cd40l可為氨基酸序列是cd40的配體的蛋白質(zhì)。

11、所述porb的編碼基因的編碼序列可為序列1；所述cd40l的編碼基因的編碼序列可為序列2。

12、上述重組腺病毒中，所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體還可含有p2a的編碼基因和t2a的編碼基因序列。

13、所述p2a可為來(lái)自豬捷申病毒(porcine?teschovirus，ptv)的自切割2a短肽，可導(dǎo)致編碼多肽的共翻譯切割。

14、所述t2a可為來(lái)自明脈扁刺蛾β四體病毒(thosea?asigna?virus)的自切割2a短肽，可導(dǎo)致編碼多肽的共翻譯切割。

15、所述p2a可為豬捷申病毒的自切割2a短肽，所述t2a可為明脈扁刺蛾β四體病毒的自切割2a短肽。

16、所述p2a的編碼基因的編碼序列可為seq.no.1的第2342-2398位核苷酸；所述t2a的編碼基因的編碼序列可為seq.no.1的第3371-3424位核苷酸。

17、上述重組腺病毒中，所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體可含有融合蛋白的編碼基因。所述融合蛋白可為arv1-p2a-arv2-t2a-arv3、arv1-p2a-arv2-t2a-arv3-p2a-porb或arv1-p2a-arv2-t2a-arv3-p2a-cd40l。所述arv1-p2a-arv2-t2a-arv3可為由所述雞呼腸孤病毒ⅲ型σc蛋白、所述雞呼腸孤病毒ⅳ型σc蛋白、所述鴨新型呼腸孤病毒σc蛋白、所述p2a和所述t2a連接而成的蛋白質(zhì)。所述arv1-p2a-arv2-t2a-arv3-p2a-porb可為由所述雞呼腸孤病毒ⅲ型σc蛋白、所述雞呼腸孤病毒ⅳ型σc蛋白、所述鴨新型呼腸孤病毒σc蛋白、所述porb、所述p2a和所述t2a連接而成的蛋白質(zhì)。所述arv1-p2a-arv2-t2a-arv3-p2a-cd40l可為由所述雞呼腸孤病毒ⅲ型σc蛋白、所述雞呼腸孤病毒ⅳ型σc蛋白、所述鴨新型呼腸孤病毒σc蛋白、所述cd40l、所述p2a和所述t2a連接而成的蛋白質(zhì)。

18、所述雞呼腸孤病毒ⅲ型σc蛋白可為如下(a1)或(a2)或(a3)：

19、(a1)氨基酸序列為序列表中序列3；

20、(a2)將(a1)經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與其具有相同功能的蛋白質(zhì)；

21、(a3)來(lái)源于雞呼腸孤病毒ⅲ型且與(a1)具有98％以上同一性且與其具有相同功能的蛋白質(zhì)。

22、所述雞呼腸孤病毒ⅳ型σc蛋白為如下(b1)或(b2)或(b3)：

23、(b1)氨基酸序列為序列表中序列4；

24、(b2)將(b1)經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與其具有相同功能的蛋白質(zhì)；

25、(b3)來(lái)源于雞呼腸孤病毒ⅳ型且與(b1)具有98％以上同一性且與其具有相同功能的蛋白質(zhì)。

26、所述鴨新型呼腸孤病毒σc蛋白為如下(c1)或(c2)或(c3)：

27、(c1)氨基酸序列為序列表中序列5；

28、(c2)將(c1)經(jīng)過(guò)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與其具有相同功能的蛋白質(zhì)；

29、(c3)來(lái)源于鴨新型呼腸孤病毒且與(c1)具有98％以上同一性且與其具有相同功能的蛋白質(zhì)。

30、所述σc蛋白的編碼基因可為如下(d1)或(d2)或(d3)：

31、(d1)編碼區(qū)序列為seq.no.1的第1349-2341位核苷酸；

32、(d2)編碼區(qū)序列為seq.no.1的第3425-4429位核苷酸；

33、(d3)編碼區(qū)序列為seq.no.1的第2399-3370位核苷酸；

34、(d4)在嚴(yán)格條件下與(d1)、(d2)或(d3)雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子；

35、(d5)來(lái)源于呼腸孤病毒且與(d1)、(d2)或(d3)限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的dna分子。

36、所述嚴(yán)格條件可為如下：50℃，在7％十二烷基硫酸鈉(sds)、0.5m?na3po4和1mmedta的混合溶液中雜交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?na3po4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；

37、還可為：50℃，在7％sds、0.5m?na3po4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?na3po4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可為：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

38、上述重組腺病毒中，所述融合蛋白的編碼基因可為下述任一種dna分子：

39、a1)核苷酸序列含有序列表中seq.no.1的第1349-2341位、第3425-4429位和第2399-3370位的dna分子；

40、a2)核苷酸序列含有seq.no.1的第1349-2341位、第3425-4429位、第2399-3370位核苷酸且含有序列1的dna分子；

41、a3)核苷酸序列含有seq.no.1的第1349-2341位、第3425-4429位、第2399-3370位核苷酸且含有序列2的dna分子。

42、上述重組腺病毒中，所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體還可含有腺病毒的反向末端重復(fù)序列(inverted?terminal?repeat,itr)。

43、上述重組腺病毒中，所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體質(zhì)?？蔀閜adc68xy3-arv123、padc68xy3-arv123-cd40l或padc68xy3-arv123-porb。

44、所述padc68xy3-arv123可為核苷酸序列是seq.no.1的雙鏈環(huán)狀dna分子。

45、所述padc68xy3-arv123-porb可為在seq.no.1的第4402-4403位核苷酸之間插入了序列表中seq.no.1的第2342-2398位核苷酸(p2a基因序列)以及序列表中序列1(porb基因序列)，并保持所述padc68xy3-arv123的其它核苷酸序列不變得到的重組表達(dá)載體質(zhì)粒。

46、所述padc68xy3-arv123-cd40l可為將seq.no.1的第4402-4403位核苷酸之間插入了seq.no.1的第2342-2398位核苷酸(p2a基因)以及序列表中序列2(cd40l基因序列)，并保持所述padc68xy3-arv123的其它核苷酸序列不變得到的重組表達(dá)載體質(zhì)粒。

47、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了生物材料，可為下述任一種：

48、1)上文所述的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體，

49、2)含有1)所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體的重組微生物或重組動(dòng)物細(xì)胞，

50、3)上文所述的融合蛋白質(zhì)，

51、4)上文所述的融合蛋白質(zhì)的核酸分子，

52、5)含有3)所述核酸分子的重組載體、重組微生物或重組動(dòng)物細(xì)胞。

53、上文所述重組腺病毒和/或上文所述生物材料在制備禽呼腸孤病毒多價(jià)疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

54、上文所述疫苗還可含有適宜的載體或賦形劑。這里的載體材料包括但不限于水溶性載體材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有機(jī)酸等)、難溶性載體材料(如乙基纖維素、膽固醇硬脂酸酯等)、腸溶性載體材料(如醋酸纖維素酞酸酯和羧甲乙纖維素等)。其中優(yōu)選的是水溶性載體材料。使用這些材料可以制成多種劑型，包括但不限于片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等。可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將單位給藥劑型制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將單位給藥劑型制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將單位給藥劑型制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。使用上述劑型可以經(jīng)注射給藥，包括皮下注射、靜脈注射、肌肉注射和腔內(nèi)注射等；腔道給藥，如經(jīng)直腸和陰道；呼吸道給藥，如經(jīng)鼻腔；粘膜給藥。上述給藥途徑優(yōu)選的是注射給藥。

55、本發(fā)明選擇目前三種流行的arv血清型的σc蛋白為抗原，僅共表達(dá)三種σc蛋白或聯(lián)合分子佐劑，以復(fù)制缺陷型的黑猩猩腺病毒為載體，構(gòu)建針對(duì)禽呼腸孤病毒的多價(jià)候選疫苗。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)估候選疫苗的免疫原性和保護(hù)效果。

56、本發(fā)明將雞呼腸孤病毒ⅳ型，ⅲ型以及鴨新型呼腸孤病毒三種流行血清型的σc蛋白基因克隆到本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的復(fù)制缺陷型重組黑猩猩腺病毒載體adc68xy3上，構(gòu)建得到了基于腺病毒載體的多價(jià)禽呼腸孤病毒候選疫苗adc68xy3-arv123。此外，本發(fā)明還在adc68xy3-arv123基礎(chǔ)上，添加了分子佐劑porb或cd40l，構(gòu)建得到了候選疫苗adc68xy3-arv123-porb、adc68xy3-arv123-cd40l。然后，本發(fā)明評(píng)估了三種多價(jià)候選疫苗誘導(dǎo)的結(jié)合抗體、中和抗體和t細(xì)胞免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)三種候選疫苗均具有較好的免疫原性。最后，通過(guò)arv活病毒s1133的感染實(shí)驗(yàn)，證明了三種候選疫苗均能夠保護(hù)小鼠不受arv活病毒的攻擊感染。

57、目前對(duì)arv的疫苗研究多以弱毒疫苗或者重組亞單位疫苗為主，尚無(wú)病毒載體疫苗的研究出現(xiàn)。本研究通過(guò)分析流行的禽呼腸孤病毒血清型，基于黑猩猩腺病毒68型載體成功構(gòu)建了新的多價(jià)禽呼腸孤病毒疫苗。采用單針肌肉免疫小鼠后，檢測(cè)結(jié)合抗體，中和抗體、t細(xì)胞免疫反應(yīng)，以及活病毒攻擊后的保護(hù)效果，結(jié)果顯示adc68xy3-arv123、adc68xy3-arv123-porb、adc68xy3-arv123-cd40l三種重組黑猩猩腺病毒候選疫苗均能誘導(dǎo)產(chǎn)生比較強(qiáng)的、持久的特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，并且對(duì)活病毒攻擊有一定的保護(hù)效果。

58、本發(fā)明在重組腺病毒載體疫苗設(shè)計(jì)中，除了arvσc蛋白以外，為了增強(qiáng)疫苗的免疫效果，還在載體中加入了porb和cd40l兩種佐劑分子基因。雖然，兩種佐劑分子均已成功表達(dá)，但誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)并未優(yōu)化未加分子佐劑的候選疫苗adc68xy3-arv123。而這兩個(gè)分子佐劑在蛋白疫苗中已證明可以增強(qiáng)蛋白疫苗的免疫原性。進(jìn)一步證明了腺病毒載體無(wú)需額外添加佐劑，其本身就有很好的免疫原性。此外，在后續(xù)的研究中，也可以將佐劑分子以蛋白的形式與重組腺病毒疫苗混合一起，制備出新的arv疫苗，檢測(cè)其是否有更改好的免疫效果產(chǎn)生。

59、與傳統(tǒng)的減毒疫苗和蛋白疫苗相比，基于腺病毒載體的候選疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)高水平的針對(duì)禽呼腸孤病毒的cd4+和cd8+t細(xì)胞免疫反應(yīng)。而蛋白疫苗誘導(dǎo)cd8+t細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力則不足。另外，一種重組腺病毒載體候選疫苗即可共表達(dá)三種禽呼腸孤病毒抗原，形成多價(jià)疫苗，同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)多種禽呼腸孤病毒的免疫反應(yīng)。而減毒活疫苗、滅活疫苗或蛋白苗如果要制備多價(jià)疫苗，需要表達(dá)純化多個(gè)病毒或蛋白抗原。對(duì)比之下，腺病毒候選疫苗制備更簡(jiǎn)單，成本更低廉。另外，傳統(tǒng)減毒疫苗和蛋白疫苗都需額外添加佐劑，腺病毒候選疫苗則不需要。