【】主張優(yōu)先權(quán)本技術(shù)要求于2022年10月11日提交的日本專利申請第2022-162901號的優(yōu)先權(quán),該申請的全部內(nèi)容通過引用并入本技術(shù)中。對于作為要求優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的在先申請的原始說明書(包括權(quán)利要求書、說明書和附圖),在先申請的申請日將被視為優(yōu)先權(quán)日(參考日),不會因本次增加的說明書而受到影響。本發(fā)明涉及一種植物來源的游離神經(jīng)酰胺,及其制造方法和分析方法?！鞠惹凹夹g(shù)】鞘脂類是一種生物膜成分,是由長鏈堿的(以下簡稱為「lcb」)以長鏈氨基醇為組成部分的脂質(zhì)的總稱。與lcb結(jié)合的脂肪酸被稱為游離神經(jīng)酰胺。存在于植物中的鞘脂類可分為,游離lcb、游離神經(jīng)酰胺(以下簡稱為「cer」)、葡萄糖基神經(jīng)酰胺(以下簡稱為「glccer」)以及糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺(以下簡稱為「gipc」)這四類。其中,游離lcb與游離神經(jīng)酰胺屬于微量成分,葡萄糖基神經(jīng)酰胺,以及gipc占生物膜脂質(zhì)的大部分。人體角質(zhì)層中存在一種擔(dān)當(dāng)皮膚屏障功能的細(xì)胞外脂質(zhì)層。游離神經(jīng)酰胺具有極長鏈(c20以上)的脂肪酸,是構(gòu)成細(xì)胞外脂質(zhì)層的主要成分,也是支持皮膚屏障功能的物質(zhì)。通過皮膚或口服補(bǔ)充游離神經(jīng)酰胺可改善皮膚功能。然而,游離神經(jīng)酰胺的天然含量很低,因此,化學(xué)合成品歷來被用于化妝品。近年來,植物來源的神經(jīng)酰胺作為護(hù)膚類功能性的一種成分備受關(guān)注。植物來源神經(jīng)酰胺是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越透明質(zhì)酸等物質(zhì)的功能性成分,其市場規(guī)模正在全球范圍內(nèi)不斷擴(kuò)大。目前,主要用作功能性食品的成分的植物來源的神經(jīng)酰胺是葡萄糖基神經(jīng)酰胺。葡萄糖基神經(jīng)酰胺由糖與長鏈(c16～18)的神經(jīng)酰胺結(jié)合而成,其結(jié)構(gòu)與具有極長鏈的脂肪酸的人類游離神經(jīng)酰胺不同。因此,它對皮膚的作用較弱,不適合用于化妝品。將其用作食品時還存在消化率低等問題。葡萄糖基神經(jīng)酰胺不能完全取代游離神經(jīng)酰胺的功能。與人體皮膚同類型的游離神經(jīng)酰胺,可作為化妝品成分直接涂抹在皮膚上,效果顯著,而且還有望改善消化和吸收。然而,游離神經(jīng)酰胺是一種稀有成分,在動物角質(zhì)層之外沒有天然積累的實(shí)例,因此目前的主流是使用化學(xué)合成方法,包括類似化合物。游離神經(jīng)酰胺作為一種安全且廉價的植物提取成分,是護(hù)膚品行業(yè)特別有前景的市場需求,并且作為食品、飲料、化妝品和藥品中的成分而受到熱切追捧。其中,gipc普遍存在于所有植物中,其含量達(dá)到葡萄糖神經(jīng)酰胺的數(shù)倍。gipc是已知地球上最豐富的含有神經(jīng)酰胺物質(zhì)。gipc是由糖鏈和極長鏈對的神經(jīng)酰胺結(jié)合在一起構(gòu)成的。也就是說,神經(jīng)酰胺部分的結(jié)構(gòu)與人體皮膚神經(jīng)酰胺相同或相似。然而,其聚糖部分極其穩(wěn)定,尚未觀察到動物消化液或腸道細(xì)菌的酶促分解。盡管gipc大量存在于我們?nèi)粘Ｊ秤玫闹参镄允澄镏?但它在生物和工業(yè)領(lǐng)域都是一種未得到充分利用的神經(jīng)酰胺資源。植物的神經(jīng)酰胺骨架和親水部分的化學(xué)構(gòu)造非常的多樣化,一個植物物種中存在的分子種類的總數(shù)可達(dá)幾百種。此外,分子組成因植物種類和組織的不同存在差異。使用普通的分析方法不容易獲得完整的信息。作為一種生產(chǎn)植物來源的游離神經(jīng)酰胺,專利文獻(xiàn)1公開了一種向使用曲霉制造發(fā)酵產(chǎn)物時產(chǎn)生的副產(chǎn)物,發(fā)酵酒糟中添加醇類溶劑,以提取和純化神經(jīng)酰胺的方法。專利文獻(xiàn)2公開了一種向栗皮提取物中添加醇類溶劑來提取,純化游離神經(jīng)酰胺的方法。專利文獻(xiàn)3公開了一種通過將未分化植物愈傷組織的破碎物在45℃下加熱處理5小時誘導(dǎo)自噬來生產(chǎn)游離神經(jīng)酰胺的方法。專利文獻(xiàn)4中,作為由gipc混合glccer制備游離神經(jīng)酰胺的方法,公開了一種用于消化gipc或glccer以產(chǎn)生游離神經(jīng)酰胺的組合物,該組合物中含有蘑菇自溶液或其純化產(chǎn)物。非專利文獻(xiàn)1中公開了,卷心菜中發(fā)現(xiàn)特異性地將gipc水解為植物神經(jīng)酰胺-1-磷酸(以下簡稱「pc1p」)的酶活性(以下簡稱「gipc-磷脂酶d」或「gipc-pld」),該酶活性在葉子組織被研磨時被活化,推測在生物體內(nèi)的pc1p在消化道內(nèi)通過磷酸酶轉(zhuǎn)化為游離神經(jīng)酰胺。非專利文獻(xiàn)2記載了一種被稱為bligh&dyer法的植物神經(jīng)酰胺的提取方法。氯仿、甲醇和水的混合液作為基本提取溶劑,有時會添加氯化鉀或鹽酸。氯仿相和水相之間的兩相分配可以去除水溶性和不溶性異物,是最常見的脂質(zhì)提取方法。非專利文獻(xiàn)3中記載了一種被稱為markham法的植物神經(jīng)酰胺相關(guān)物質(zhì)的提取方法。該方法以異丙醇作為提取溶劑,可以有效地提取含gipc等植物神經(jīng)酰胺相關(guān)物質(zhì)。非專利文獻(xiàn)4公開了一種利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)分析植物鞘脂類的結(jié)構(gòu)多樣性的方法。但是專利文獻(xiàn)1、2的方法僅僅是通過使用醇類溶液重復(fù)或多次提取和純化的工序來獲得原料中已經(jīng)存在的游離神經(jīng)酰胺?？紤]到原料中游離神經(jīng)酰胺的含量,這些方法效率不高。專利文獻(xiàn)3的方法,需要預(yù)先準(zhǔn)備用于培養(yǎng)未分化植物的愈傷組織的培養(yǎng)基和裝置,因此并不簡便,并且對于大量生產(chǎn)來說效率也不高。此外,專利文獻(xiàn)3的方法需要加熱(45～70℃)的步驟,以使混合物處于自噬誘導(dǎo)的條件。并且,由于自噬是發(fā)生在活細(xì)胞中的生理現(xiàn)象,因此植物原料僅限于活細(xì)胞。專利文獻(xiàn)4的方法中,蘑菇自溶液分解了利用價值很高的glccer,而不是僅選擇性地將gipc分解為游離神經(jīng)酰胺的方法。此外,蘑菇自溶液無需要單獨(dú)的制備步驟。并且,該方法工藝復(fù)雜,還需要從植物原料中提取gipc和glccer等預(yù)處理。此外,蘑菇不是植物,而是真菌。使用蘑菇自溶液的方法利用的是不同的酶,不能被視為僅使用植物來源成分生產(chǎn)游離神經(jīng)酰胺的制造方法。非專利文獻(xiàn)1的方法中,為了從gipc最終獲得游離神經(jīng)酰胺,在體外條件下,首先需要利用gipc-pld分解gipc得到pc1p,然后利用磷酸酶將pc1p去磷酸化。非專利文獻(xiàn)1的方法需要兩種不同的酶,效率不高。非專利文獻(xiàn)2的方法適用于提取游離神經(jīng)酰胺和glccer,但由于有機(jī)相中根本無法回收gipc,因此不適合植物神經(jīng)酰胺相關(guān)物質(zhì)的全面分析。并且氯仿毒性高,近年來傾向于避免使用。非專利文獻(xiàn)3的方法現(xiàn)需要較長的提取工序,并且需要使用大量的提取容器。此外,由于使用大量的揮發(fā)性較低的含水溶劑,因此需要較長的時間來蒸發(fā)和去除溶劑。并且,由于未進(jìn)行兩相分配,因此存在大量雜質(zhì)。特別是多糖的混入會降低lc-ms/ms測定的gipc的定量值。非專利文獻(xiàn)4的方法中,雖然記載了通過高效液相色譜法(以下簡稱為「hplc」)和采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜法(以下簡稱為「mrm」)的組合,能夠全面的掌握各植物鞘脂類分子種類含量和組成,但是并未公開同時分析游離神經(jīng)酰胺,gipc和glccer的方法。還指出,為了簡單全面地分析具有多種結(jié)構(gòu)的植物鞘脂類分子,仍有許多問題需要解決。例如,一個植物種類中存在的分子種類總數(shù)達(dá)到幾百種,并且分子組成因植物物種和植物組織部位的不同而不同。然而,典型的mrm分析中可同時檢測到的分子數(shù)量僅限于50到100個左右,因此很難掌握整體情況?！粳F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】【專利文獻(xiàn)】【專利文獻(xiàn)1】專利公開號2012-41518【專利文獻(xiàn)2】wo2018/021476【專利文獻(xiàn)3】專利公開號2019-115318【專利文獻(xiàn)4】專利公開號2021-103950【非專利文獻(xiàn)】【非專利文獻(xiàn)1】喜田孝史等:脂質(zhì)營養(yǎng)學(xué),第25卷(1)、p.75～85、2016年【非專利文獻(xiàn)2】e?g?bligh,w?j?dyer:canadian?journal?of?biochemistry?andphysiology?1959august；37(8):911-917【非專利文獻(xiàn)3】jennifer?e?markham?et?al:j?biol?chem.2006aug；281(32):22684-94【非專利文獻(xiàn)4】今井博之等:生化學(xué),第88卷(1)、p.94～104、2016年

背景技術(shù)：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、【發(fā)明所要解決的課題】

2、本發(fā)明是為了解決所述課題而提出的,其目的在于提供一種從植物原料中所含的gipc選擇性地、簡便且高效地生產(chǎn)植物來源的游離神經(jīng)酰胺的方法。本發(fā)明的另一個目的在于,提供一種從植物中高效提取游離神經(jīng)酰胺的方法。本發(fā)明的另一個目的在于,提供一種很短的時間內(nèi)同時分析植物來源的游離神經(jīng)酰胺,gipc和glccer的方法。

3、【解決課題的方法】

4、本發(fā)明人針對現(xiàn)有技術(shù)的問題點(diǎn)進(jìn)行了深入研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)-通過應(yīng)用以除愈傷組織以外的植物中所含的gipc為底物的磷脂酶c的活性,可以簡便且高效地生產(chǎn)植物來源的游離神經(jīng)酰胺；通過使用特定的提取溶劑,可以高效地提取植物來源的游離神經(jīng)酰胺；并且,通過將hplc與分時段mrm(schedule-mrm)(檢測時差設(shè)定)組合,可以在短時間內(nèi)同時分析植物來源的游離神經(jīng)酰胺,gipc及glccer?；谶@些發(fā)現(xiàn),本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)改進(jìn)直至完成了本發(fā)明。

5、即,本發(fā)明提供了以下發(fā)明。

6、〔1〕內(nèi)源性酶的活化步驟,破壞愈傷組織以外的植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu),獲得以糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺為底物,植物細(xì)胞內(nèi)源性的磷脂酶c被活化的植物體破碎物；

7、以及分解步驟20～30℃的溫度范圍內(nèi),使所述含植物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺物質(zhì)與植物體破碎物單獨(dú)和/或與其他含來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),從而利用磷脂酶c將物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺選擇性地分解為游離神經(jīng)酰胺。

8、〔2〕根據(jù)〔1〕所述的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法,其中,含有所述糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺物質(zhì)為下述物質(zhì)中的任意一種或者組合。

9、(a)含有糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的所述植物體。

10、(b)含有糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺異種植物體。

11、(c)糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,其使從所述植物體中提取的提取物。

12、(d)糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,其是從異種植物體中提取的提取物。

13、〔3〕根據(jù)〔1〕所述的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法,其中,所述分解步驟中的植物體破碎物與含有糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的混合重量比為1:0～1:150。

14、〔4〕一種植物來源的游離神經(jīng)酰胺,其是通過〔1〕～〔3〕中任意一項(xiàng)所述的制造方法。

15、〔5〕一種飲食產(chǎn)品根據(jù)〔4〕所述含有植物來源的游離神經(jīng)酰胺的。

16、〔6〕一種化妝品根據(jù)〔4〕所述含有植物來源的游離神經(jīng)酰胺的。

17、〔7〕一種醫(yī)藥品根據(jù)〔4〕所述含有植物來源的游離神經(jīng)酰胺的。

18、〔8〕一種從根據(jù)〔1〕記載的制造方法獲得的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的提取方法,包括以下步驟:向試樣中加入1-丁醇/甲醇混合液進(jìn)行提取處理；并在弱堿性條件下處理試樣以分解酯類脂質(zhì)。

19、向分解步驟后的試樣中加入1-丁醇和強(qiáng)酸,在酸性條件下將試樣分離為兩層,回收上層的1-丁醇,得到含有游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物。

20、〔9〕一種由〔1〕所述的制造方法獲得的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的分析方法,其包括以下步驟:

21、向試樣中加入1-丁醇/甲醇混合液進(jìn)行提取,然后在弱堿性條件下處理試樣以分解酯類脂質(zhì)；

22、向所述分解步驟后的試樣中加入1-丁醇和強(qiáng)酸,在酸性條件將試樣分離為兩層,回收上層的1-丁醇,得到含有游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物；分析過程中,將所述提取物導(dǎo)入到液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中,采用反相色譜柱的液相色譜儀分離提取物中的游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺,同時用質(zhì)譜儀對所述分離出的三種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析的分析步驟；

23、在所述分析步驟中,執(zhí)行分時段的mrm測量以選擇性地只檢測所述3種物質(zhì)分別從液體色譜儀溶出的時間段,同時定時定量分析包含在上述提取物中的所述3種物質(zhì)?！?0〕將通過

24、〔1〕所述的制造方法制造的游離神經(jīng)酰胺準(zhǔn)備為分析試樣的工序；

25、將熱處理或冷凍干燥處理后的植物體破碎物,作為對照試樣；

26、將1-丁醇/甲醇混合液添加到每個試樣中進(jìn)行提取處理,然后在弱堿性條件下處理試樣以分解酯類脂質(zhì)；

27、向所述分解步驟后的試樣中加入1-丁醇和強(qiáng)酸,在酸性條件下將試樣分離為兩層,回收上層的1-丁醇,得到含有游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物；

28、分析過程中,將各提取物導(dǎo)入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中,利用反相色譜柱的液相色譜儀分離提取物中的游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺利用質(zhì)譜儀對分離出的所述3種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析的分析步驟；

29、在所述分析步驟中,執(zhí)行經(jīng)分時段的mrm測量以選擇性地只檢測所述3種物質(zhì)分別從液體色譜儀溶出的時間段,同時測定包含在上述提取物中的所述3種物質(zhì),并通過將游離神經(jīng)酰胺的量與糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的量進(jìn)行比較以評估游離神經(jīng)酰胺的生成量。

30、【發(fā)明的效果】

31、根據(jù)本發(fā)明的制造方法,可以提供一種從植物原料中所含的gipc選擇性地,簡便且高效地制造植物來源的游離神經(jīng)酰胺的方法。

32、本發(fā)明的制造方法中,植物體內(nèi)大量存在的gipc是通過磷脂酶c以植物體內(nèi)源性的gipc為底物而直接分解的,不需要依賴異源酶或特殊的化學(xué)處理。gipc不僅在所有植物中大量存在,而且由于其穩(wěn)定性和較差的溶解性,所以會被認(rèn)為它在植物廢物中大量殘留。根據(jù)本發(fā)明的制造方法,可以將以往未曾利用的gipc分解,直接生成游離神經(jīng)酰胺。而且不需要特殊的栽培植物材料或復(fù)雜的技術(shù),可以簡單、快速、大量且低成本地生產(chǎn)游離神經(jīng)酰胺。

33、通過本發(fā)明的制造方法獲得的游離神經(jīng)酰胺可以用作例如包含功能性食品的化妝品,醫(yī)藥品等的成分或原料。

34、另外,根據(jù)本發(fā)明的提取方法,還可以提供植物來源的游離神經(jīng)酰胺,gipc以及glccer的方法。

35、另外,根據(jù)本發(fā)明的分析方法可以提供,在短時間內(nèi)同時分析植物來源的游離神經(jīng)酰胺,gipc以及glccer的方法。

36、植物中含有種類繁多的神經(jīng)酰胺相關(guān)物質(zhì),其分子組成因植物種類和組織不同而有很大差異。本發(fā)明的分析方法可以獲得全面涵蓋這些所有的定量數(shù)據(jù),并且對于建立以各種植物物種為原料批量生產(chǎn)游離神經(jīng)酰胺的方法做出巨大貢獻(xiàn)。

37、【圖式簡單說明】

38、【圖1】顯示本發(fā)明的分析方法中的分時段的mrm整體圖像和所有色譜圖的疊加的圖。

39、【圖2】顯示評價植物神經(jīng)酰胺相關(guān)物質(zhì)的提取效率的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。

40、【圖3】顯示靜置30分鐘后擬南芥破碎物中g(shù)ipc的分解和游離神經(jīng)酰胺的生成結(jié)果的圖

41、【圖4】顯示擬南芥破碎物靜置10～60分鐘后,gipc的分解和游離神經(jīng)酰胺的生成結(jié)果的圖。

42、【圖5】顯示不同植物體中g(shù)ipc的分解和游離神經(jīng)酰胺的生成結(jié)果的圖。

43、【圖6】顯示利用擬南芥破碎物分解異種植物體(胡蘿卜)中的gipc并生成游離神經(jīng)酰胺的結(jié)果的圖。

44、【圖7】顯示來自大豆的gipc通過擬南芥破碎物分解并產(chǎn)生游離神經(jīng)酰胺的結(jié)果的圖。

45、【圖8】顯示金針菇自溶液與擬南芥破碎物的比較,以及與其他異源植物(胡蘿卜)混合后的gipc的分解與游離神經(jīng)酰胺的生成結(jié)果的圖。

46、【圖9】顯示在擬南芥破碎物中添加gipc-pld時gipc的分解和游離神經(jīng)酰胺的生成結(jié)果的圖。

47、【圖10】gipc分解途徑推測機(jī)制示意圖。

48、【圖11】顯示典型的gipc結(jié)構(gòu)圖。

49、【圖12】磷脂酶(plc)從gipc生成游離神經(jīng)酰胺的示意圖。

50、【圖13】顯示了不同分解酶(pld或plc)導(dǎo)致的反應(yīng)物的差異的圖。

51、【圖14】顯示了根據(jù)分解步驟中的溫度條件不同,導(dǎo)致產(chǎn)生的游離神經(jīng)酰胺生成量的差的圖。

52、【實(shí)施方式】

53、以下根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行說明。需要注意的是,下述實(shí)施例所示的配置僅僅是示例,本發(fā)明不限于這些構(gòu)成。

54、植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法

55、本發(fā)明的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法包括:內(nèi)源性酶的活化步驟,其中破壞除愈傷組織以外的植物體的細(xì)胞結(jié)構(gòu),以獲得植物體破碎物,所述植物體破碎物是使以內(nèi)源于所述植物體細(xì)胞中的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺為底物的磷脂酶c活化的；以及

56、分解步驟,其中破碎物在20～30℃的溫度范圍內(nèi)與單獨(dú)和/或其他的含植物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),從而通過磷脂酶c將植物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺選擇性地分解為游離神經(jīng)酰胺。

57、(內(nèi)源性酶的活化步驟)

58、在內(nèi)源性酶的活化步驟中,破壞除愈傷組織以外的植物體的細(xì)胞結(jié)構(gòu),得到以糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺為底物的植物細(xì)胞內(nèi)源的被活化的植物體破碎物磷脂酶c。

59、在本發(fā)明中,植物體包括植物個體以及其一部分,例如葉,莖,根等植物器官以及植物組織,種子和果實(shí)。另外,本發(fā)明的植物體也包含植物性廢棄物(植物性殘?jiān)?,但不包含未分化植物的愈傷組織。

60、作為植物體,可列舉十字花科植物(卷心菜、蘿卜、小蘿卜、西蘭花、小松菜、擬南芥、小白菜、水菜等)、傘形科植物(胡蘿卜、芹菜、日本香菜、芫荽、當(dāng)歸等)、豆科植物(大豆、綠豆芽等)、百合科植物(洋蔥,大蔥等)、唇形科植物(羅勒、赤地藏、青紫蘇、紫蘇等)、葫蘆科植物(黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆等)、各種蔬菜廢棄物、水果皮和種子、豆粕、咖啡渣、釀酒廠廢棄物等,但不僅限于此。

61、本說明書中的「破碎」是指,細(xì)胞膜被破碎,活細(xì)胞被破壞,以至于植物體中所含的酶變得活化的狀態(tài)。具體地說,就是組織塊已充分微細(xì)化。例如,作為破碎狀態(tài),是指看不到數(shù)毫米左右大的塊狀物,即使繼續(xù)進(jìn)行破碎處理也不會進(jìn)一步微細(xì)化的均勻懸浮液,即所謂的均漿狀態(tài)。

62、作為破碎手段,例如,只要能產(chǎn)生足以破壞活細(xì)胞的剪切力,可以使用任何方法。如攪拌器(waring攪拌器)、食品加工機(jī)、均質(zhì)機(jī)、和超聲波處理等機(jī)械方法。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中,當(dāng)使用攪拌器(waring攪拌器)時,可以通過處理1至10分鐘將材料破碎,直至材料達(dá)到所述破碎狀態(tài)。

63、破碎時,植物體可以是新鮮,干燥,冷凍等任何狀態(tài),但必須含有水分。例如,當(dāng)使用干燥品時,在破碎前添加干燥品重量的5～20倍的水。另外,由于冷凍后的植物的細(xì)胞膜會因冷凍而受損,因此如果將冷凍的植物破碎后使用,可以有效地獲得游離的神經(jīng)酰胺。

64、破碎時間可根據(jù)所述植物體的量以及破碎手段來適當(dāng)設(shè)定。

65、作為植物內(nèi)存在的酶,可列舉脂質(zhì)分解酶即磷脂酶c。磷脂酶c是一種在廣泛存在于多種植物中的酶,通常會切割甘油磷脂脂質(zhì)側(cè)的甘油磷酸鍵。本說明書中,有時會將以糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺為底物生成糖鏈和游離神經(jīng)酰胺磷脂酶c稱為「gipc-磷脂酶c」或「gipc-plc」。

66、催化gipc-plc酶促反應(yīng)的蛋白質(zhì)的主體尚不清楚。但是,如后述實(shí)施例所示,gipc的減少量與游離神經(jīng)酰胺的增加量幾乎為等量,而將非專利文獻(xiàn)1中公開的gipc-pld添加到反應(yīng)體系中,游離神經(jīng)酰胺并沒有增加。因此,本發(fā)明中觀察到的游離神經(jīng)酰胺的增加量是直接由gipc產(chǎn)生的,即支持了gipc-plc活性的存在。

67、所述植物體中,十字花科植物,尤其是擬南芥含有高活性的gipc―plc。因此,十字花科植物的破碎物作為反應(yīng)底物可以高效地制造游離神經(jīng)酰胺。

68、gipc-plc的有效溫度范圍通常為20～30℃。所以,所述內(nèi)源性酶的活化步驟中的溫度條件優(yōu)選在20～30℃溫度范圍內(nèi),從促進(jìn)酶促反應(yīng)的角度考慮,溫度范圍優(yōu)選為20～28℃,更優(yōu)選為20～25℃。

69、(分解步驟)

70、在分解步驟中,在20～30℃的溫度范圍內(nèi),將所述植物體破碎物單獨(dú)以及/或其他含有植物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),從而通過磷脂酶c將植物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺選擇性地分解為游離神經(jīng)酰胺。

71、所述分解步驟的反應(yīng)溫度,從gipc-plc的活性溫度范圍的角度考慮,優(yōu)選在20～30℃的范圍內(nèi),從促進(jìn)酶促反應(yīng)角度考慮,優(yōu)選在20～28℃的范圍內(nèi),更優(yōu)選為20～25℃。

72、所謂使植物體破碎物單獨(dú)進(jìn)行反應(yīng),是指例如將植物體破碎物靜置于容器中,與植物體中存在的gipc-plc以及植物體中的gipc進(jìn)行反應(yīng)。

73、所述植物體破碎物與來自其他植物的含gipc的物質(zhì)反應(yīng)是指,例如將所述植物體破碎物與來源于其他植物的含gipc物質(zhì)放入同一容器內(nèi)進(jìn)行混合。

74、混合方式?jīng)]有特別限制,但優(yōu)選在攪拌的同時進(jìn)行混合。此類混合裝置的例子包括但不限于普通的攪拌器(例如,waring攪拌器、諾塔攪拌器、亨舍爾攪拌器、蝶形攪拌器等)、食品加工機(jī)、均質(zhì)機(jī)、攪拌器等。

75、在本說明書中「使所述植物體破碎物單獨(dú)和/或其他的含有植物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺物質(zhì)反應(yīng)」是指,使所述植物體破碎物在單獨(dú)反應(yīng)時,所述植物體破碎物和其他的含有植物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺反應(yīng),以及所述物質(zhì)的組合。

76、所述分解步驟的反應(yīng)時間例如為10分鐘～48小時,優(yōu)選為10分鐘～24小時?？筛鶕?jù)所述植物體破碎物的量和所述植物來源的含有g(shù)ipc物質(zhì)的量做適宜的設(shè)定。

77、所述含有g(shù)ipc的物質(zhì)為下列任意一項(xiàng)或其組合。

78、(a)含有g(shù)ipc的所述植物體；

79、(b)含有g(shù)ipc的異種植物體；

80、(c)所述植物體中提取的提取物即gipc；

81、(d)異種植物體中提取的提取物即gipc。

82、含有g(shù)ipc的植物類型如所述內(nèi)源性酶的活化步驟部分所示。該分解步驟中使用的含gipc的植物體可以是植物體本身的gipc分解酶活性弱的植物,也可以是不具有g(shù)ipc分解酶活性的植物,還可以是gipc分解酶活性被失活的植物。

83、含有g(shù)ipc的植物體可以是新鮮的,干燥物或者冷凍物的任何狀態(tài),但必須是含有水分的狀態(tài)。當(dāng)使用干燥物時,例如,添加干燥物重量的5～20倍的水。

84、含有g(shù)ipc的植物體的形態(tài)例如可以為整塊、片狀、切碎、切片、粗磨、顆粒、粉末或糊狀(均質(zhì)化)等。從與所述植物體破碎物高效地發(fā)生反應(yīng)的觀點(diǎn)考慮,優(yōu)選將植物粉碎得較細(xì),更優(yōu)選在內(nèi)源性酶活化過程中,使用粉碎手段將組織塊充分破碎直至植物的細(xì)胞膜被破碎、直至活細(xì)胞被破壞的程度,更優(yōu)選為使植物成為糊狀(均質(zhì)化)的狀態(tài)。

85、在所述分解步驟中,所述植物體破碎物與所述含gipc物質(zhì)的混合重量比例為1:0～1:150。在所述混合重量比中,1:0表示植物體破碎物中所含的gipc被分解,即表示所述植物體破碎物并非混合物而是單獨(dú)使用。

86、從短時間且高效率的得到游離神經(jīng)酰胺角度考慮,所述植物體破碎物與所述gipc混合成分重量比的優(yōu)選范圍在1:0～1:10,1:0～1:4為最佳。

87、所述內(nèi)源性酶的活化步驟與所述分解步驟可以按次順序進(jìn)行,也可以同時并行進(jìn)行。例如,所述植物體中十字花科植物,特別是擬南芥含有高活性的gipc―plc。將該十字花科植物與其他含有g(shù)ipc物質(zhì)(例如gipc分解酶活性較低的植物體)放入同一容器內(nèi)混合后破碎,在20～30℃的溫度范圍內(nèi)靜置使其發(fā)生反應(yīng),從而使所述內(nèi)源性酶的活化步驟與分解步驟同時進(jìn)行。

88、根據(jù)所述制造方法得到的植物來源的游離神經(jīng)酰胺是根據(jù)以下的方法提取得到。

89、植物來源的游離神經(jīng)酰胺的提取方法

90、本發(fā)明關(guān)于植物來源的游離神經(jīng)酰胺的提取方法,是通過本發(fā)明的制造方法獲得的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的提取方法,其包括以下步驟:

91、在試樣中加入1-丁醇/甲醇混合液進(jìn)行提取處理,在弱堿性條件下處理試樣,以分解酯類脂質(zhì)；

92、向所述分解步驟后的試樣中加入1-丁醇和強(qiáng)酸,在酸性條件下將試樣分離為兩層,回收上層的1-丁醇可得到含有游離神經(jīng)酰胺,糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物。

93、(分解步驟)

94、在分解步驟中,用1-丁醇/甲醇混合液提取試樣,然后在弱堿性條件下處理以分解酯類脂質(zhì)。

95、這里所說的「試樣」是指通過本發(fā)明的制造方法得到的植物來源的游離神經(jīng)酰胺,是指包含經(jīng)過內(nèi)源性酶的活化步驟以及分解步驟的植物體破碎物的任意試樣。試樣可以直接使用,或者也可以進(jìn)行預(yù)處理和/或制備。

96、1-丁醇/甲醇混合液中,1-丁醇與甲醇的體積比通常為1:6～6:1(v:v)或者該范圍內(nèi)的任意值,優(yōu)選為1:4～4:1(v:v)或該范圍內(nèi)的任意值,更加優(yōu)選為1:3～3:1(v:v)或該范圍內(nèi)的任意值,甚至更加優(yōu)選為2:1(v:v)。

97、試樣中加入1-丁醇/甲醇混合液進(jìn)行提取處理的溫度通常在50℃以上,優(yōu)選為75℃以上。反應(yīng)時間通常在5分鐘以上,優(yōu)選為10分鐘以上。

98、在弱堿性條件下的堿性劑,包括例如氫氧化鈉和氫氧化鉀等。堿性劑可以單獨(dú)使用一種,也可以兩種以上組合使用。

99、1-丁醇/甲醇混合液與堿性劑的體積比通常為1:6～6:1(v:v)或者該范圍內(nèi)的任意值,優(yōu)選為1:4～4:1(v:v)或該范圍內(nèi)的任意值,更優(yōu)選為1:3～3:1(v:v)或該范圍內(nèi)的任意值,甚至更優(yōu)選為1:0.3～1:0.6(v:v)或該范圍內(nèi)的任意值。根據(jù)混合比例的不同,溶液可能會分離成兩層,此時,加入少量甲醇,使混合溶劑混合均勻,可以促進(jìn)有機(jī)層中所含酯類脂質(zhì)的分解。

100、在堿性條件下處理時,反應(yīng)溫度的下限通常為20℃以上,優(yōu)選為30℃以上,更優(yōu)選為45℃以上。上限通常為70℃以下,優(yōu)選為60℃以下,更優(yōu)選為55℃以下。因此,反應(yīng)溫度通常為20～70℃,優(yōu)選為30～60℃,更優(yōu)選為45～55℃。反應(yīng)時間通常在5分鐘以上,優(yōu)選是10分鐘以上。在這種弱堿性條件下進(jìn)行的處理會分解試樣中的酯類脂質(zhì)。

101、(獲得提取物的步驟)

102、在獲得提取物的步驟中,想經(jīng)過所述分解步驟的試樣中加入1-丁醇與強(qiáng)酸,在酸性條件下分離兩層,回收上層的1-丁醇,其中得到含有游離神經(jīng)酰胺,糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物。

103、所述分解步驟后的試樣與1-丁醇以及強(qiáng)酸的體積比通常為1:1.5:1.5～1:3:5(v:v:v)或該范圍內(nèi)的任意值,優(yōu)選為1:2:3(v:v:v)。

104、強(qiáng)酸包括例如鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸等無機(jī)酸。強(qiáng)酸可以單獨(dú)使用,或者兩種以上組合使用。

105、通常在酸性條件下對1-丁醇/甲醇混合液和水進(jìn)行兩相分配,可以在1-丁醇相中回收游離神經(jīng)酰胺,糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺,并可以將干擾成分(例如多糖)在內(nèi)的夾雜物質(zhì)去除到水相中。從1-丁醇相中回收的提取物含有總脂質(zhì),包括由gipc親水部分逐步裂解形成的分解中間物。

106、(其他步驟)

107、提取物經(jīng)過蒸發(fā)除去溶劑等步驟后,即可得到植物來源的游離神經(jīng)酰胺。

108、根據(jù)本發(fā)明的制造方法得到的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的主要的脂肪酸鏈長,是根據(jù)植物種而多少有些不同,但都與人類相同以c24左右為中心,且大多分布在c22～c26之間。在這方面,它不同于主要由c16～c20組成的葡萄糖基神經(jīng)酰胺,也不同于單分子種類的合成神經(jīng)酰胺。

109、本發(fā)明的提取方法可以從皂化到兩相分配的步驟可在一個容器中完成,從而減少了工序數(shù)量。此外,由于使用的溶劑量比傳統(tǒng)技術(shù)少,因此可以使用小容量容器同時提取多個試樣。此外,由于提取物是通過兩相分配在少量有機(jī)溶劑中獲得的,因此可以在短時間內(nèi)完成蒸發(fā)去除。本發(fā)明的提取方法對植物神經(jīng)酰胺有關(guān)物質(zhì)的回收率優(yōu)于markham法,特別是根據(jù)多糖的去除可以改善gipc的lc-ms/ms的檢測靈敏度。現(xiàn)有技術(shù)與本發(fā)明的提取方法的比較總結(jié)于表1中。

110、【表1】

111、

112、*1提取和皂化過程中使用的藥物

113、*2兩相分配后最終液量,一般標(biāo)準(zhǔn)

114、*3使用離心分離器等通用設(shè)備進(jìn)行1次提取操作所需的時間和可處理的標(biāo)本數(shù)

115、植物來源的游離神經(jīng)酰胺的分析方法1

116、本發(fā)明中植物來源的游離神經(jīng)酰胺的分析方法,是分析通過所述制造方法得到的游離神經(jīng)酰胺的分析方法,其包括以下步驟:

117、將1-丁醇/甲醇混合液添加到試樣中進(jìn)行提取,在弱堿性條件下處理試樣以分解酯類脂質(zhì)；

118、向所述分解步驟后的試樣中加入1-丁醇與強(qiáng)酸,在酸性條件下將試樣分離成兩層,回收上層的1-丁醇,得到含有游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物；將所述提取物導(dǎo)入到液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,并利用反相色譜柱的液相色譜儀分離提取物中的游離神經(jīng)酰胺,糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺同時利用質(zhì)譜儀對分離出的三種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)樸分析；

119、在所述分析步驟中,執(zhí)行分時段的mrm測量以選擇性地只檢測所述3種物質(zhì)分別從液體色譜儀溶出的時間段,同時定時定量分析包含在上述提取物中的所述3種物質(zhì)。

120、(分解步驟)

121、(獲得提取物的步驟)

122、所述步驟已在本發(fā)明的提取方法的詳細(xì)說明中進(jìn)行了描述。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中,將1-丁醇/甲醇(體積比為2:1)混合液加入試樣中,在75℃以上處理10分鐘以上,再加入0.3～1倍量的強(qiáng)堿(例如1n氫氧化鉀等),在45～70℃處理10分鐘以上,使酯類脂質(zhì)分解,再加入1.5～3倍量(體積)的1-丁醇和1.5～5倍量(體積)的強(qiáng)酸(例如0.4n鹽酸等),使試樣酸化并使其兩層分離,回收上層1-丁醇,得到含有游離神經(jīng)酰胺,糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物。

123、(分析步驟)

124、在分析步驟中,將所述提取物導(dǎo)入到液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中,使用反相色譜柱通過液相色譜儀分離提取物中的游離神經(jīng)酰胺,gipc以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺,再利用質(zhì)譜儀對分離出的3種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析的分析步驟,

125、在所述分析步驟中,執(zhí)行分時段的mrm測量(multiple?reaction?monitoring)以選擇性地僅檢測3種物質(zhì)從液相色譜儀中溶出的時間段,同時定時定量分析包含在上述提取物中的所述的3種物質(zhì)。

126、這里所指的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀是,例如,液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀或液相色譜儀四極桿/飛行時間(q-tof)質(zhì)譜儀。

127、通常,在這種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中,可以任意確定分析參數(shù),以最大程度地提高檢測靈敏度,即對于使用反相色譜柱進(jìn)行液相分離后的提取物中的每種成分獲得最佳條件。

128、植物神經(jīng)酰胺和相關(guān)代謝物的結(jié)構(gòu)類型列表如表2所示。

129、【表2】

130、

131、表中親水部分的「glc」代表葡萄糖,「oh」代表羥基,「hex」代表己糖,「hexn」代表己糖胺、「hexnac」代表n-乙酰己糖胺。另外,在神經(jīng)酰胺的骨架的「t18:0」等這樣的表示法中,「t」表示其具有3個羥基,「18」表示碳原子數(shù),最后的數(shù)字「0」表示雙鍵的數(shù)量。此外,「d」是指二羥基堿。

132、執(zhí)行分時段的mrm測量以便選擇性地僅檢測所述3種物質(zhì)分別從液相色譜儀中溶出的時間段(例如,溶出時間±1分鐘)。例如gipc的溶出時間為6～19分鐘,glccer的溶出時間為15～25分鐘,cer的溶出時間為20～30分鐘。這使得重疊分子的數(shù)量可以限制為100個以下,并可以同時測量1000種或更多種分子種類。針對植物神經(jīng)酰胺這種大規(guī)模同時分析手段是前所未有的。

133、根據(jù)本發(fā)明的分析方法,可以根據(jù)所得到的信號強(qiáng)度確定存在的所述3種物質(zhì)的量,并可以獲得鞘脂類的總量和各分子種類的組成。圖一顯示了本發(fā)明的分析方法中分時段的mrm的整體圖像和所有色譜圖的疊加。

134、植物來源的游離神經(jīng)酰胺的分析方法2

135、本發(fā)明的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的分析方法包括以下步驟。通過本發(fā)明的制造方法制造的游離神經(jīng)酰胺作為分析試樣準(zhǔn)備的步驟；

136、將植物體進(jìn)行加熱處理或者冷凍干燥處理后進(jìn)行破碎,將其作為對照試樣準(zhǔn)備的步驟；

137、將1-丁醇/甲醇混合液混合物添加到各試樣中進(jìn)行提取處理,然后在弱堿性條件下處理試樣以分解酯類脂質(zhì)的步驟；

138、向所述分解步驟后的試樣中加入1-丁醇和強(qiáng)酸,在酸性條件下將試樣分離為兩層,回收上層的1-丁醇,得到含有游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物的步驟；

139、在分析步驟中,將所述各提取物導(dǎo)入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,利用反相色譜柱的液相色譜儀分離提取物中的游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺,利用質(zhì)譜儀對分離出的3種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析；

140、在所述分析步驟中,執(zhí)行分時段的mrm測量以選擇性地只檢測所述3種物質(zhì)分別從液體色譜儀溶出的時間段,同時測定包含在上述提取物中的所述3種物質(zhì),并通過比較游離神經(jīng)酰胺的量和糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的量進(jìn)行比較以評價游離神經(jīng)酰胺的生成量。

141、(制備分析試樣的步驟)

142、制備通過本發(fā)明的制造方法生產(chǎn)的植物來源的游離神經(jīng)酰胺作為待分析的試樣。本發(fā)明的制造方法的詳細(xì)情況如上所述。測量之前,建議通過如下所述的熱處理來預(yù)滅活待分析試樣中植物體中的酶。

143、(制備對照試樣的步驟)

144、在制備對照試樣的步驟中,將植物體加熱處理或冷凍干燥處理后破碎,制備成對照試樣。

145、進(jìn)行熱處理是為了使植物體內(nèi)的酶失活。處理溫度例如為80～100℃,優(yōu)選為95～100℃。處理時間例如為1～30分鐘,優(yōu)選為5～20分鐘。加熱方法可以采用例如水浴或直接火焰加熱,但不僅限于此。

146、冷凍干燥步驟是為了通過冷凍干燥阻止植物中固有的酶發(fā)生反應(yīng)。冷凍干燥的方法沒有特別限制,例如可以適當(dāng)采用將植物放入容器中,用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥的方法。具體地,例如可以在-40℃以下的溫度下冷凍植物體后,真空處理,在-20℃～30℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行干燥。

147、破碎手段已經(jīng)在本發(fā)明的制造方法的部分進(jìn)行了詳細(xì)的描述。

148、(分解步驟)

149、(獲得提取物的步驟)

150、所述步驟已經(jīng)在本發(fā)明的提取方法的部分進(jìn)行了詳細(xì)的描述。

151、(分析步驟)

152、所述分析步驟包括:分析步驟中,將所述各提取物導(dǎo)入到液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中,采用反相色譜柱的液相色譜儀分離提取物中的游離神經(jīng)酰胺,糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺再利用質(zhì)譜儀對分離出的三種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析的分析步驟；

153、在所述分析步驟中,執(zhí)行分時段的mrm測量以選擇性地只檢測所述3種物質(zhì)分別從液體色譜儀溶出的時間段,同時測定包含在上述提取物中的所述3種物質(zhì),并通過將游離神經(jīng)酰胺的量與糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的量進(jìn)行比較以評估游離神經(jīng)酰胺的生成量。

154、根據(jù)本發(fā)明的分析方法,可以根據(jù)所得到的信號強(qiáng)度確定存在的所述3種物質(zhì)的量,并可以獲得鞘脂類的總量和各分子種類的組成。此外,根據(jù)本發(fā)明的分析方法,將待分析試樣與對照試樣進(jìn)行比較的結(jié)果可以揭示,存在于原料植物體中的gipc-plc分解gipc并直接產(chǎn)生游離神經(jīng)酰胺。根據(jù)本發(fā)明的分析方法,構(gòu)建了植物神經(jīng)酰胺庫,該庫涵蓋了各種植物原料中可能存在的所有已知和未知的分子種類,并且檢測集中在單個分子的洗脫時間上,從而可以一次分析超過1,000種分子種類。這使得定量掌握神經(jīng)酰胺代謝步驟的全貌并快速準(zhǔn)確地評估游離神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生效率成為可能。

155、【實(shí)施例】

156、以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的特點(diǎn)進(jìn)行更詳細(xì)的說明。但本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例。

157、<植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造>

158、1.擬南芥破碎物中的gipc的分解與游離神經(jīng)酰胺生成

159、實(shí)施例1·對照例1

160、使用攪拌器(商品名:waring攪拌器、型式hgbss型號、由waring公司制造)將1.0g新鮮的擬南芥蓮座葉破碎處理約10分鐘,直到組織塊充分細(xì)碎成均勻的懸浮液,即所謂的勻漿狀態(tài)。將所得的破碎物在25℃下靜置30分鐘后進(jìn)行反應(yīng),通過內(nèi)源性磷脂酶c將來源于擬南芥的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺選擇性地分離為游離神經(jīng)酰胺,從而生成實(shí)施例1的游離神經(jīng)酰胺。將1.0g新鮮的擬南芥蓮座葉在95℃下熱處理10分鐘,使內(nèi)源性酶失活后,在與實(shí)施例1相同的條件下用攪拌器進(jìn)行破碎。將所得破碎物作為對照例1。

161、<評價植物神經(jīng)酰胺關(guān)聯(lián)物質(zhì)的抽出效率的初步實(shí)驗(yàn)>

162、(a)擬南芥葉子,(b)將水稻葉子冷凍干燥后破碎成粉末狀。利用各30mg試樣,采用本發(fā)明的提取方法(利用1-丁醇/甲醇混合液的方法),利用氯仿的方法(bligh&dyer法),以及利用異丙醇的方法(markham方法)的三種提取方法提取獲得提取物,然后采用lc-ms/ms對glccer、cer、gipc進(jìn)行定量。回收率(％)以本發(fā)明的提取方法的檢測強(qiáng)度為100％時的相對強(qiáng)度來評價。bligh&dyer法基于文獻(xiàn)中公開的方法(e?g?bligh,w?j?dyer:canadianjournal?of?biochemistry?and?physiology?1959august；37(8):911-917)進(jìn)行操作。markham法依據(jù)文獻(xiàn)(jennifer?e?markham?et?al:j?biol?chem.2006aug；281(32):22684-94)公開的方法進(jìn)行操作。結(jié)果表明,兩種方法的glccer和cer的回收率相當(dāng),但gipc的回收率根據(jù)方法不同而有很大差異,其中本發(fā)明的提取方法表現(xiàn)出最佳值。結(jié)果如圖2所示。

163、<植物來源的游離神經(jīng)酰胺的提取>

164、將1-丁醇/甲醇(體積比2:1)混合液加入到實(shí)施例1與對照例1中,并將混合物在80℃下加熱10分鐘。冷卻后加入0.6倍量(體積量)的1n氫氧化鉀,并將混合物在50℃下處理20分鐘以分解酯類脂質(zhì)。然后向每個試樣中加入2倍量(體積量)的1-丁醇和3倍量(體積量)的0.4n鹽酸,使其酸化并分離成兩層。收集上層丁醇層,減壓除去溶劑,獲得含有游離神經(jīng)酰胺,gipc,以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物。

165、<植物來源的游離神經(jīng)酰胺的分析>

166、在下列條件下使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀以多反應(yīng)監(jiān)測multiple?reactionmonitoring(mrm)模式對所述提取物進(jìn)行檢測和定量。

167、設(shè)備:島津lc-ms8030、esi、mrm模式(神經(jīng)酰胺:[m+h]+>[lcb+h]+、葡萄糖基神經(jīng)酰胺:[m+h]+>[lcb+h]+、gipc:[m+h]+>[cer+h]+)、霧化器流速1.5l/min、加熱塊溫度:400℃、溶液a:四氫呋喃/甲醇/5mm甲酸銨(150:100:250)+0.1％甲酸、溶液b:四氫呋喃/甲醇/5mm甲酸銨(350:100:50)+0.1％甲酸、梯度條件:0分鐘,a/b＝90:10>35分鐘,a/b＝0:100,色譜柱:島津glc?sceptor?c18(3μm,2.1×75mm)、流速:0.2ml/min

168、在所述分析條件下,對3種物質(zhì)進(jìn)行同時定量分析。另外,通過比較實(shí)施例和對照例的游離神經(jīng)酰胺與gipc的測量值(3次重復(fù)測量的平均值),評價了游離神經(jīng)酰胺的生成量(nmol/g)。如表3以及圖3所示。

169、【表3】

170、??????????????????????????????????????????????????????????單位:nmol/g

171、

172、將實(shí)施例1與對照例1進(jìn)行比較可知,實(shí)施例1中的大部分的gipc(約80％)被分解,選擇性地生成了游離神經(jīng)酰胺(表3、圖3)。對照例1的結(jié)果表明,當(dāng)預(yù)先加熱植物體組織以滅活內(nèi)源性酶時,不會產(chǎn)生gipc的分解以及游離神經(jīng)酰胺的生成?，F(xiàn)有技術(shù)(專利文獻(xiàn)3)中,推測分化后的植物在破碎處理后再進(jìn)行加熱處理(45℃)時,葡萄糖基神經(jīng)酰胺會因自噬而分解,但在非加熱條件下(25℃)進(jìn)行反應(yīng)的實(shí)施例1中,葡萄糖基神經(jīng)酰胺的量幾乎沒有變化(另見后述實(shí)施例22)。推測其原因在于,由于被破碎所導(dǎo)致的勻漿導(dǎo)致活細(xì)胞死亡。

173、實(shí)施例2·對照例2

174、將1.0g新鮮的擬南芥蓮座葉在與實(shí)施例1相同條件下用攪拌器破碎。將所得的破碎物在25℃下靜置10、20、30以及60分鐘進(jìn)行反應(yīng),通過內(nèi)源性磷脂酶c將來自擬南芥的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺選擇性地分解為游離神經(jīng)酰胺,生成實(shí)施例2的游離神經(jīng)酰胺。將1.0g新鮮的擬南芥蓮座葉在95℃下加熱處理10分鐘,使內(nèi)源性酶失活后,用攪拌器同樣進(jìn)行破碎,將得到的破碎物作為對照例2。

175、對于實(shí)施例2和對照例2,采用與所述實(shí)施例1以及對照例1相同的方法進(jìn)行游離神經(jīng)酰胺的定量分析,游離神經(jīng)酰胺與糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的量的對比來評價游離神經(jīng)酰胺的生成量(nmol/g)。結(jié)果如表4和圖4所示。

176、【表4】

177、??????????????????????????????????????????????????????????單位:nmol/g

178、

179、實(shí)施例2與對照例2的比較可知,實(shí)施例2中,破碎后約10分鐘發(fā)生急速的gipc的分解,此后反應(yīng)緩慢地進(jìn)行(表4、圖4)。

180、2.gipc在各種植物體中的分解和游離神經(jīng)酰胺的生成

181、實(shí)施例3～12·對照例3～12

182、除了使用表5所示的新鮮的植物體各1.0g以外,利用與實(shí)施例1相同的方法制備來自各植物體的游離神經(jīng)酰胺。對照例3～12的獲得方式與對照例1相同。各實(shí)施例中的破碎物的靜置時間(反應(yīng)時間)為1小時或24小時。

183、【表5】

184、

185、關(guān)于實(shí)施例3～12和對照例3～12,與所述實(shí)施例1和對照例1同樣的方法進(jìn)行游離神經(jīng)酰胺的同時定量分析,評價脂質(zhì)組成(mol％)。結(jié)果如圖5所示。

186、如圖5所示,gipc被各種植物體中存在的gipc-plc分解,并且觀察到游離神經(jīng)酰胺的增加。1小時后表現(xiàn)出最高的gipc分解活性的是擬南芥。隨著時間的推移,gipc的分解不斷進(jìn)行,所有植物種類中的游離神經(jīng)酰胺的含量均增加。另一方面,由于葡萄糖基神經(jīng)酰胺的量幾乎不隨時間變化,因此表明實(shí)施例3～12中觀察到的反應(yīng)是,與現(xiàn)有技術(shù)(專利文獻(xiàn)3)所示的自噬完全不同的gipc特異性分解酶反應(yīng)。

187、此外,關(guān)于實(shí)施例3～5中,評估了gipc分解24小時后的游離神經(jīng)酰胺組成中脂肪酸鏈長的分布(mol％)。結(jié)果如表6所示。

188、【表6】

189、

190、如表6所示,通過本發(fā)明的制造方法得到的植物來源的游離神經(jīng)酰胺,雖然因植物種類的不同而存在一些差異,但認(rèn)為其主要成分為,與人型相同的c24。

191、3.擬南芥破碎物對異種植物中g(shù)ipc的分解

192、實(shí)施例13·對照例13

193、將0.5g新鮮的擬南芥蓮座葉與1.0g胡蘿卜混合,所述胡蘿卜已在95℃加熱處理10分鐘以滅活內(nèi)源性酶,然后使用攪拌器(產(chǎn)品名:waring攪拌器、型式hgbss、waring社製)將混合物破碎直到組織塊充分細(xì)碎成均勻的懸浮液或均質(zhì)狀態(tài),換言之破碎3分鐘直至均漿狀態(tài)。將所得破碎物在25℃下靜置30分鐘、1小時、3小時、6小時、以及24小時進(jìn)行反應(yīng),而生成游離神經(jīng)酰胺。將1.0g新鮮的擬南芥蓮座葉在95℃下加熱處理10分鐘,使內(nèi)源性酶失活,然后在攪拌器中破碎,所得破碎物作為對照例13。

194、關(guān)于實(shí)施例13和對照例13,與所述實(shí)施例1和對照例1同樣地進(jìn)行游離神經(jīng)酰胺的同時定量分析,評價生成的游離神經(jīng)酰胺的量(nmol/g)。各植物體試樣的組成成分如表7所示,游離神經(jīng)酰胺和gipc隨時間的變化如表8和圖6所示。圖6中基線處的游離神經(jīng)酰胺和gipc的量,顯示的是對照例13中擬南芥的值。

195、【表7】

196、

197、【表8】

198、??????????????????????????????????????????????????????????單位:nmol/g

199、

200、實(shí)施例13中,隨著靜置時間(反應(yīng)時間)的增加,胡蘿卜中g(shù)ipc進(jìn)行分解,轉(zhuǎn)化成游離神經(jīng)酰胺的量也增加(圖6)。3、6以及24小時后gipc轉(zhuǎn)化為游離神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化效率分別為約75％、約90％、約95％。

201、4.擬南芥破碎物分解大豆來源的gipc

202、實(shí)施例14·對照例14

203、將從大豆中提取的10nmolgipc在氮?dú)饬飨赂稍?添加相當(dāng)于0.1g擬南芥蓮座葉的均質(zhì)狀態(tài),使用超聲波處理裝置(產(chǎn)品名為us-2ks,s.n.d株式會社制造)在25℃下超聲波處理30秒使其懸浮。將所得懸浮液在25℃下靜置30分鐘、1小時、3小時、6小時以及24小時進(jìn)行反應(yīng),生成游離神經(jīng)酰胺。

204、將0.1g新鮮的擬南芥蓮座葉在95℃下加熱處理10分鐘,使內(nèi)源性酶失活,然后用攪拌器破碎,所得破碎物作為對照例14。

205、對于實(shí)施例14和對照例14,與所述實(shí)施例1和對照例1同樣地進(jìn)行游離神經(jīng)酰胺的同時定量分析,評價生成的游離神經(jīng)酰胺的量(nmol)。各試樣的組成如表9所示,游離神經(jīng)酰胺和gipc隨時間的變化如表10和圖7所示。圖7中基線處的游離神經(jīng)酰胺和gipc的量是對照例14的擬南芥的數(shù)值。

206、【表9】

207、

208、【表10】

209、????????????????????????????????????????????????????????????單位:nmol

210、

211、在實(shí)施例14中,隨著靜置時間的增加,來源于大豆的gipc也隨之進(jìn)行分解,并且轉(zhuǎn)化為游離神經(jīng)酰胺的gipc的量也增加(圖7)。這表明也可以從植物體組織中提取的gipc生產(chǎn)出游離神經(jīng)酰胺。

212、5.通過將含有g(shù)ipc-plc的試樣與不同種類的植物體的混合的游離神經(jīng)酰胺的制造

213、實(shí)施例15～20·對照例15

214、將在95℃下加熱處理10分鐘以滅活內(nèi)源性酶與0.01g(實(shí)施例15)、0.05g(實(shí)施例16)、0.1g(實(shí)施例17)、0.25g(實(shí)施例18)、0.5g(實(shí)施例19)、以及1.0g(實(shí)施例20)新鮮的擬南芥蓮座葉混合,將混合物在攪拌器中壓碎直至均勻。將得到的破碎物在25℃下放置3小時進(jìn)行反應(yīng),生成游離神經(jīng)酰胺。將1.0g胡蘿卜(可食用部分)在95℃下加熱處理10分鐘,使內(nèi)源性酶失活后,用攪拌器破碎,所得破碎物作為對照例15。

215、比較例1、2

216、金針菇冷凍一夜后,放入25℃的恒溫槽內(nèi)自行消化,24小時后加入edta,再放入食品加工機(jī)中破碎。將破碎物進(jìn)行固液分離,將液體部分制備為金針菇自溶液。將在95℃下加熱處理10分鐘,使內(nèi)源性酶失活的1.0g胡蘿卜與相當(dāng)于0.25g(比較例1)或1.0g(比較例2)的金針菇自溶液混合,然后在攪拌器中破碎。將所得的破碎物在25℃下靜置3小時,以生產(chǎn)游離神經(jīng)酰胺。

217、對于實(shí)施例15～20、對照例15、比較例1～2,使用與所述實(shí)施例1和對照例1相同的方法進(jìn)行游離神經(jīng)酰胺的分析,求出gipc與游離神經(jīng)酰胺的比例(％)。結(jié)果如圖8所示。

218、如圖8所示,gipc向游離神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化效率與添加的植物體破碎物(含酶試樣)的量相關(guān)。為了在短時間內(nèi)生成游離神經(jīng)酰胺,植物體破碎物與含gipc物質(zhì)混合重量比優(yōu)選為1:1～1:4,但即使植物體破碎物的混合比例較低,也可以通過延長反應(yīng)時間來提高轉(zhuǎn)化效率。比較例2中,相當(dāng)于1.0g金針菇的金針菇自溶液的gipc分解率僅約為7％,而實(shí)施例16中,使用0.05g擬南芥時的gipc分解率約為15％。若比較各含分解酶的試樣在相同重量當(dāng)量下的轉(zhuǎn)化率,則0.25g當(dāng)量的實(shí)施例18與比較例1之間觀察到約6.33倍的差異。1.0g當(dāng)量的實(shí)施例20與7比較例2之間觀察到了約5.5倍的差異。由以上結(jié)果可知,實(shí)施例15～20的擬南芥破碎物相比于比較例1～2中的金針菇自溶液具有更高的gipc分解活性。另外,實(shí)施例15～20的擬南芥破碎物可以通過在非加熱條件(25℃)破碎即可簡單地制備,而比較例1～2的金針菇自溶液需要冷凍、解凍和自溶植物的步驟以及提取步驟。從這一點(diǎn)考慮到,實(shí)施例15～20與比較例1～2相比,可以更簡便且高效地生產(chǎn)植物來源的游離神經(jīng)酰胺,其優(yōu)勢得到了體現(xiàn)。

219、6.驗(yàn)證與已知gipc分解途徑(gipc-pld途徑)的差異

220、實(shí)施例21·對照例21

221、使用攪拌器將1.0g新鮮的擬南芥蓮座葉破碎直至均勻。將得到的破碎物在25℃下靜置60分鐘進(jìn)行反應(yīng),生成游離神經(jīng)酰胺。將1.0g新鮮的擬南芥蓮座葉在95℃下加熱處理10分鐘,使內(nèi)源性酶失活后,用攪拌器進(jìn)行破碎,將得到的破碎物作為對照例21。

222、比較例3

223、將擬南芥來源的gipc-pld基因引入大腸桿菌表達(dá)載體pbad-dest49(thermofisher?scientific),獲得來源于大腸桿菌的重組gipc-pld酶。將1.0g新鮮的擬南芥蓮座葉與所述10μg源自大腸桿菌的gipc-pld酶混合,用攪拌器破碎直至均勻。將所得破碎物在25℃下靜置60分鐘進(jìn)行反應(yīng),生成游離神經(jīng)酰胺。

224、對于實(shí)施例21、對照例21、比較例3,與所述實(shí)施例1以及對照例1同樣地進(jìn)行游離神經(jīng)酰胺分析,評價生成的游離神經(jīng)酰胺的量(mol％)。結(jié)果如圖9所示,推測的gipc分解途徑的機(jī)理如圖10所示。

225、如圖9所示,當(dāng)在擬南芥破碎物中添加gipc-pld時,gipc降低并且植物神經(jīng)酰胺-1-磷酸(pc1p)會增加,但是游離神經(jīng)酰胺并沒有增加(比較例3)。從這一結(jié)果表明,植物體破碎物產(chǎn)生游離神經(jīng)酰胺是通過plc途徑,與pc1p介導(dǎo)的pld途徑無關(guān)(圖10)。先前的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)1)表明,在卷心菜中發(fā)現(xiàn)了特異性地將gipc水解為pc1p的gipc-pld,并且pc1p在小腸中的堿性磷酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺可能性較高。但是,如圖10所示,作為gipc的分解途徑,如果產(chǎn)生游離神經(jīng)酰胺的pld途徑是分解gipc的內(nèi)在途徑,那么通過從外部添加pld,游離神經(jīng)酰胺的量也應(yīng)該會增加。然而,游離神經(jīng)酰胺的量并沒有增加,反而略有減少。這一結(jié)果說明,plc途徑作為gipc的主要的分解途徑,pld途徑的貢獻(xiàn)很小且微乎其微。

226、gipc具有神經(jīng)酰胺-磷酸-肌醇-寡糖的結(jié)構(gòu)(圖11),通過該神經(jīng)酰胺與磷酸之間的磷酸酯鍵斷裂,而生成游離的神經(jīng)酰胺(圖12)。切割該部分的酶稱為gipc-plc。由上述的游離神經(jīng)酰胺的分析結(jié)果可知,gipc的減少與游離神經(jīng)酰胺的增加大致為等量,并且如比較例3所示,在反應(yīng)體系中添加gipc-pld后游離神經(jīng)酰胺也沒有增加,這表明增加的游離神經(jīng)酰胺是由gipc直接生成的,表明存在plc活性(圖13)。

227、7.根據(jù)分解步驟中的溫度條件不同,游離神經(jīng)酰胺生成量也不同

228、實(shí)施例22·對照例22

229、將1.0g新鮮的擬南芥座葉用攪拌器破碎直至均勻。將所得的破碎物在25℃下靜置3小時,生成游離神經(jīng)酰胺。將1.0g新鮮擬南芥蓮座葉在95℃下加熱處理10分鐘,使內(nèi)源性酶失活后,用攪拌器進(jìn)行破碎,將得到的破碎物作為對照例22。

230、比較例4

231、將1.0g新鮮的擬南芥座葉用攪拌器破碎直至均勻。將所得的破碎物在45℃下靜置3小時,生成游離神經(jīng)酰胺。

232、對于實(shí)施例22、對照例22、比較例4,與所述實(shí)施例1以及對照例1同樣地進(jìn)行游離神經(jīng)酰胺的分析,評價生成的游離神經(jīng)酰胺的量(nmol/g)。結(jié)果如表11和圖14所示

233、【表11】

234、??????????????????????????????????????????????????????????單位:nmol/g

235、

236、如圖14所示,25℃(實(shí)施例22)與45℃(比較例4)進(jìn)行比較表明,在45℃的高溫條件下gipc進(jìn)行活躍地分解,但相對于gipc和glccer分解率增加,與在25℃相比游離神經(jīng)酰胺的生成量并沒有增加,反而有減少的傾向。由此推測,在45℃的高溫條件下,會發(fā)生包括游離神經(jīng)酰胺的分解反應(yīng)在內(nèi)的各種分解反應(yīng)。另一方面,在25℃下,僅發(fā)生gipc的分解反應(yīng),不發(fā)生游離神經(jīng)酰胺和glccer的分解反應(yīng)。由上可知,利用gipc-plc生產(chǎn)游離神經(jīng)酰胺的適宜的溫度范圍為20～30℃。

237、以下闡述了作為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的在最初申請的所附權(quán)利要求書中所描述的發(fā)明。附錄中所列的權(quán)利要求號與在最初申請?jiān)降臋?quán)利要求號相同。

238、1.一種植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法,包括以下步驟:

239、內(nèi)源性酶的活化步驟,將植物體破碎,得到以糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺為底物,所述植物內(nèi)源性的磷脂酶c被活化的植物體破碎物；

240、分解步驟中,使所述植物體破碎物與含有植物來源的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的物質(zhì)反應(yīng),將所述糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺分解為游離神經(jīng)酰胺。

241、2.所述含糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的物質(zhì)為下列任意一種或者組合,根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法,其特征在于:

242、(a)所述植物體內(nèi)所含的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺。

243、(b)異種植物中含有的糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺。

244、(c)糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,其是從所述植物體中提取的提取物。

245、(d)糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺,其實(shí)從所述異種植物體中提取的提取物。

246、3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法所述分解步驟,其中,所述植物體破碎物與含所述糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺材料的混合重量比為1:0～1:150。

247、4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法,其中,所述分解步驟的反應(yīng)溫度在20～30℃的范圍內(nèi)。

248、5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法產(chǎn)生的游離神經(jīng)酰胺作為待分析試樣；

249、將加熱處理或冷凍干燥處理后的植物體破碎物,作為對照試樣；

250、向所述每個試樣中添加溶劑,得到含有游離神經(jīng)酰胺、糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺、以及葡萄糖基神經(jīng)酰胺的提取物；

251、將所述各提取物導(dǎo)入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,采用反相色譜柱液相色譜儀分析提取物中的游離神經(jīng)酰胺和和糖基肌醇,以及分離磷酸神經(jīng)酰胺和葡萄糖基神經(jīng)酰胺,同時利用質(zhì)譜儀對分離出的所述3種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量分析的分析步驟；

252、所述提取步驟為,向各試樣中加入1-丁醇/甲醇(體積比2:1)混合液,在75℃以上處理10分鐘以上,再加入0.3～1倍量(體積)的1n氫氧化鉀,在45～70℃處理10以上,使酯類脂質(zhì)分解,向分解步驟后的各試樣中加入1.5～3倍量(體積)的1-丁醇和1.5～5倍量(體積)的0.4n鹽酸,酸化分離成兩層,回收上層的1-丁醇；

253、該植物來源的游離神經(jīng)酰胺的分析方法所述分析步驟包括,在分析步驟中執(zhí)行分時段的mrm測定,以便選擇性地僅檢測所述3種物質(zhì)從液相色譜儀中洗脫的時間,從而同時測量每個試樣中所含的3種物質(zhì),并通過將游離神經(jīng)酰胺的量與糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺的量進(jìn)行比較來評估產(chǎn)生的游離神經(jīng)酰胺。

254、【產(chǎn)業(yè)上的利用可能性】

255、本發(fā)明的制造方法在以下兩個方面具有前景。首先是現(xiàn)有的游離神經(jīng)酰胺原料的高品質(zhì)化。例如,可以從已經(jīng)在食品和化妝品中使用的植物原料的新鮮農(nóng)產(chǎn)品,加工產(chǎn)品,殘留物等中生成游離神經(jīng)酰胺。此外,游離神經(jīng)酰胺的產(chǎn)量等于或大于現(xiàn)有的植物來源的葡萄糖基神經(jīng)酰胺的產(chǎn)量。本發(fā)明的制造方法可以提高植物來源的游離神經(jīng)酰胺的功能性和附加價值,有助于提高質(zhì)量。其次是,植物廢棄物的資源化。該技術(shù)用途廣泛,可以利用農(nóng)民、農(nóng)產(chǎn)品市場和食品工業(yè)的植物廢棄物作為神經(jīng)酰胺的原料。目前,農(nóng)業(yè)廢棄物是通過耕作土壤等方式被動處理,但通過積極利用它,我們可以為可持續(xù)發(fā)展目標(biāo)做出貢獻(xiàn)。這也將有助于農(nóng)民返還利潤并降低原材料成本。本發(fā)明的制造方法對于作為功能性食品、化妝品、藥品等的成分或原料所使用的植物來源的游離神經(jīng)酰胺的制造方法也是有用的。本發(fā)明的提取方法可以近乎100％地回收,所有分子種類的神經(jīng)酰胺相關(guān)物質(zhì),因此十分有用。此外,本發(fā)明的分析方法具有可同時分析植物來源的游離神經(jīng)酰胺、gipc以及超過1000種以上的葡萄糖神經(jīng)酰胺的分子種類,因此十分有用。